本试剂盒仅供科研使用
6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)试剂盒说明书
(货号:WS5080F 分光法 48 样)
一、产品简介:
6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH;EC 1.1.1.49)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,是磷酸
戊糖途径的关键酶,同时维持 NADPH 在细胞内的水平,NADPH 反过来维持细胞中谷胱甘肽水平进而保
护细胞免受氧化损伤。因此 G6PDH 活性的高低可以从一定程度上反映生物体的生物合成和抗氧化能力。
G6PDH 催化 6-磷酸葡萄糖氧化为 6 -磷酸葡萄糖酸内酯,同时将 NADP+还原为 NADPH,传统方法是
检测 NADPH 在 340nm 处的吸光值。由于 NADPH 的摩尔消光系数(
ε)较低,所以这种方法灵敏度低,
且严重受到干扰。
本试剂盒提供一种简单,灵敏,快速的测定方法:该酶促过程产生的 NADPH 与特异显色剂反应产生
在 450nm 处有最大吸收峰的有色物质,通过检测 450nm 处的增加速率,进而计算出 G6PDH 酶活性大小。
二、试剂盒组成和配制:
试剂名称
规格
保存要求
备注
提取液
液体 60mL×1 瓶
4℃保存
试剂一
液体 50mL×1 瓶
4℃保存
试剂二
粉剂 mg×1 瓶
4℃保存
临用前甩几下使粉体落入底部,再加 38mL
试剂一充分溶解,用不完试剂 4℃保存。
试剂三
液体 1.1mL×2 支
4℃保存
标准品
粉剂 mg×1 支
-20℃保存 若重新做标曲,则用到该试剂。
三、所需的仪器和用品:
可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿(光径 1cm)、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、
研钵、冰。
四、6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)活性测定:
建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验
样本和试剂浪费!
1、样本制备:
① 组织样本:称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆。12000rpm 4℃离心
15min,取上清,置冰上待测。
【注】:若增加样本量,可按照组织质量(
g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例提取
② 细菌/细胞样本:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取 500 万细菌或细胞
加入 1mL 提取液;超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,
重复 30 次);4ºC 约 12,000rpm 离心 10min,取上清作为待测样品。
【注】:若增加样本量,可按照细菌/细胞数量(104):提取液(mL)为 500~1000:1 的比例进行提取。
③ 液体样本:直接检测。若浑浊,离心后取上清检测。
2、上机检测:
① 可见分光光度计预热 30min 以上,设置温度 37℃,调节波长至 450nm,蒸馏水调零。
② 试剂放在 37℃水浴 5min;在 1mL 玻璃比色皿中依次加入:
试剂名称(
μL)
测定管
样本
40
试剂二
720
试剂三
40
混匀,立即于 450nm 处读取 A1 值,20min 后读取 A2 值,
(观察:酶活性越大,则黄色越明显),ΔA=A2-A1。本试剂盒仅供科研使用
2
【注】:若ΔA 过小,可以延长反应时间(如:60min 或更长)再读取 A2,
或加大样本取样量(如增加到 0.2g),重新调整的反应时间 T 需代入
计算公式重新计算。
五、结果计算:
1、标准曲线方程:y = 0.0321x + 0.0069,x 是 NADPH 摩尔质量:nmol,y 是ΔA。
2、按样本蛋白浓度计算:
单位定义:在 37℃,每毫克组织蛋白每分钟使 1 nmol 6-磷酸葡萄糖氧化成 1 nmol 6 -磷酸葡
萄糖酸内酯并且使 1 nmol NADP+转换成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。
G6PDH(nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.0069)÷0.0321]÷ (V1×Cpr)÷T=38.94×(ΔA-0.0069)÷Cpr
3、按样本鲜重计算:
单位定义:在 37℃,每克组织每分钟使 1 nmol 6-磷酸葡萄糖氧化成 1 nmol 6 -磷酸葡萄糖酸
内酯并且使 1 nmol NADP+转换成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。
G6PDH(nmol/min/g 鲜重)=[(ΔA-0.0069)÷0.0321]÷(W×V1÷V) ÷T=38.94×(ΔA-0.0069)÷W
4、按细胞数量计算:
单位定义:在 37℃,每 104个细胞每分钟使 1 nmol 6-磷酸葡萄糖氧化成 1 nmol 6 -磷酸葡萄糖
酸内酯并且使 1 nmol NADP+转换成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。
G6PDH(nmol/min/104 cell)=[(ΔA-0.0069)÷0.0321]÷(500×V1÷V)÷T=0.078×(ΔA-0.0069)
5、液体样本中 G6PDH 活力计算:
单位的定义:在 37℃,每毫升液体每分钟使 1 nmol 6-磷酸葡萄糖氧化成 1 nmol 6 -磷酸葡萄
糖酸内酯并且使 1 nmol NADP+转换成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。
G6PDH(nmol/min/mL)=[(ΔA-0.0069)÷0.0321]÷V1÷T=38.94×(ΔA-0.0069)
V---加入提取液体积,1 mL;
V1---加入样本体积,0.04 mL; W---样本质量,g。
T---反应时间,20 min;若加大了反应时间,则重新调整的反应时间值要代入公式重新计算;
Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL;建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。
附:标准曲线制作过程:
1 制备标准品母液(1nmol/μL):向标准品 EP 管里面加入 0.6mL 蒸馏水(母液需在两
天内用且-20℃保存)。
2 把母液稀释成六个浓度梯度的标准品:0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1. nmol/μL。
3 依据 40μL 标准品+720μL 试剂一+40μL 试剂三,混匀后室温 5min 后于 450nm 处读
值,根据结果即可制作标准曲线。