本试剂盒仅供科研使用
乙醛脱氢酶(acetaldehyde dehydrogenase,ALDH)试剂盒说明书
(货号:WS8280F 分光法 48 样)
一、产品简介:
乙醛脱氢酶(ALDH,EC 1.2.1.10)是醛脱氢酶的一种,广泛存在于各种动物、植物和
微生物体内。主要作用是将乙醛氧化成乙酸,在酒精代谢中起主要作用。
本公司提供一种简单,快速,可靠的定量 ALDH 酶活性的方法。在这个测定中,乙醛
被 ALDH 氧化产生 NADH,然后将无色探针还原成有色产物,在 450nm 处具有强吸光度,
即可得到乙醛脱氢酶(ALDH)酶活性大小。
二、试剂盒的组成和配制:
试剂名称
规格
保存要求
备注
提取液
液体 60mL×1 瓶
4℃保存
试剂一
粉体 mg×1 瓶
4℃保存
临用前离心或甩几下使粉体落入
底部,再加4.2mL蒸馏水溶解备用。
试剂二
液体 2.5mL×1 瓶
4℃保存
试剂三
液体 70mL×1 瓶
4℃保存
试剂四
液体µL×1 支
-20℃保存
临用前取两支新的 EP 管,向其中
一支先加 1.1mL 蒸馏水,再迅速吸
取 0.1mL 的试剂四至蒸馏水中,混
匀备用。(该试剂极易挥发,所以
吸取操作时动作需迅速)
标准品
粉体 mg×1 支
4℃保存
若重新做标曲,则用到该试剂。
三、所需的仪器和用品:
可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿(光径 1cm)、可调式移液器、研钵、天平、离心
机、蒸馏水。
四、乙醛脱氢酶(ALDH)酶活测定:
建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验
样本和试剂浪费!
1、样本制备:
① 组织样本:
称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆。12000rpm,4℃离心 10min,
取上清置冰上待测。
【注】:若增加样本量,可按照组织质量(
g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例进行提取
② 液体样本:直接检测。若浑浊,离心后取上清检测。
2、上机检测:
① 可见分光光度计预热 30 min 以上,调节波长到 450nm,蒸馏水调零。
② 所有试剂解冻至室温(25℃),依次在 1mL 玻璃比色皿(光径 1cm)中加入:
试剂名称(µL)
测定管
对照管
样本
80
80
试剂一
40
40
试剂二
25
25
试剂三
615
655
试剂四
40本试剂盒仅供科研使用
2
混匀,30s 时于 450nm 处读取各管吸光值 A1,30min
后读取各管吸光值 A2,△A=(A2-A1)测定﹣(A2-A1)
对照(每个样本需做一个自身对照)。
【注】若△A 值在零附近徘徊,可加大样本量(如:40µL,则试剂三相应减少),或者延
长反应时间 T,则改变后的样本体积 V1 和反应时间 T 需代入计算公式重新计算。
五、结果计算:
1、标准曲线方程:y=0.0364x-0.0069;x 是 NADH 摩尔质量(nmol),y 是△A。
2、按蛋白浓度计算:
酶活定义:每毫克蛋白每分钟催化生成 1nmol NADH 的酶量为 1 个酶活单位。
ALDH 酶活(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0069)÷0.0364]÷(Cpr×V1÷V) ÷T
=11.45×(ΔA+0.0069)÷Cpr
3、按样本质量计算:
酶活定义:每克样品每分钟催化生成 1nmol NADH 的酶量为 1 个酶活单位。
ALDH 酶活(nmol/min/g 鲜重)=[(ΔA+0.0069)÷0.0364] ÷(W×V1÷V) ÷T
=11.45×(ΔA+0.0069)÷W
4、按液体体积计算:
酶活定义:每毫升液体样本每分钟催化生成 1nmol NADH 的酶量为 1 个酶活单位。
ALDH 酶活(nmol/min/mL)=[(ΔA+0.0069)÷0.0364]÷V1÷T
=11.45×(ΔA+0.0069)
V---加入提取液体积,1 mL;
V1---加入样本体积,0.08mL;
T---反应时间,30 min;
W---样本质量,g;
Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL;建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。
附:标准曲线制作过程:
1 制备标准品母液(1nmol/μL):向标准品 EP 管里面加入 1.41mL 蒸馏水(母液需在
两天内用且-20℃保存)。
2 把母液稀释成六个浓度梯度的标准品:0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5. nmol/μL。也可根据实
际样本来调整标准品浓度。
3 依据对照管加样表操作,根据结果即可制作标准曲线。