本试剂盒仅供科研使用
乙醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase, ADH)试剂盒说明书
(货号：WS6080W 微板法 96 样)
一、产品简介：
乙醇脱氢酶(ADH，EC 1.1.1.1)存在于许多生物体中，在人类和许多其他动物中，能分解
有毒的醇类; 在酵母和许多细菌中，一些醇脱氢酶催化的逆反应作为发酵的一部分。
本试剂盒提供一种快速、灵敏的检测方法：乙醇脱氢酶催化乙醇和 NAD+生成乙醛和
NADH，产生的 NADH 与特异的显色剂反应，产生在 450nm 处有最大吸收峰的黄色物质，
通过检测该黄色物质在 450nm 的增加速率，进而计算出乙醇脱氢酶活性的大小。
二、试剂盒组成和配制：
试剂名称
规格
保存要求
备注
提取液
液体 100mL×1 瓶
4℃保存
试剂一
液体 50mL×1 瓶
4℃保存
试剂二
液体μL×1 支
4℃保存
临用前甩几下或离心使试剂落入底
部，再加 1.1mL 蒸馏水溶解备用。
试剂三
粉体 mg×1 瓶
4℃保存
临用前甩几下使试剂落入底部，再加
35mL 试剂一溶解备用。
试剂四
液体 2mL×1 支
4℃保存
标准品
粉剂 mg×1 支
-20℃保存
若重新做标曲，则用到该试剂
三、所需的仪器和用品：
酶标仪、96 孔板、台式离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。
四、乙醇脱氢酶(ADH)活性测定：
建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验
样本和试剂浪费！
1、样本制备：
① 组织样本：
建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆。12000rpm, 4℃离心 10min，
取上清，置冰上待测。
【注】：若增加样本量，可按照组织质量（
g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取
② 细菌/培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数
量（104个）：建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，
功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；12000rpm, 4℃离心 10min，取上
清，置冰上待测。
【注】：若增加样本量，可按照数量（104 个）：提取液体积为 500~1000：1 的比例进行提取
③ 液体样本：直接检测。若浑浊，离心后取上清检测。
2、上机检测：
① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 450nm。
② 试剂放在 37℃水浴 5min；
③ 在 96 孔板中按照下表依次加入试剂：
试剂名称（
μL）
测定管
对照管
样本
20
20
试剂二
10
试剂三
160
170
试剂四
10
10
混匀，立即 450nm 下读取各管 A1 值，避光反应 15min本试剂盒仅供科研使用
2
后读取各管 A2 值。ΔA=（A2-A1）测定管-（A2-A1）
对照管（每个样本需做一个自身对照）。
【注】：若ΔA 过小，可以适当增加样本体积（如增加至 30μL，则试剂三相应
减少），或延长反应时间（如：60min 或更长），重新调整后的样本体
积 V1 和反应时间 T 需代入计算公式重新计算。
五、结果计算：
1、标准曲线：y = 0.1019x - 0.0087；x 是 NADH 摩尔质量（nmol），y 是ΔA。
2、按样本蛋白浓度计算
定义：每毫克组织蛋白每分钟催化 1 nmolNAD+生成 1nmol NADH 定义为一个酶活单位。
ADH(nmol/min /mg prot)=[(ΔA+0.0087)÷0.1019]÷(V1×Cpr) ÷T=32.7×(ΔA+0.0087)÷Cpr
3、按样本鲜重计算
定义：每克组织每分钟催化 1 nmolNAD+生成 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
ADH(nmol/min/g 鲜重)=[(ΔA+0.0087)÷0.1019]÷(W×V1÷V)÷T=32.7×(ΔA+0.0087)÷W
4、按细菌/细胞密度计算：
定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化 1 nmolNAD+生成 1nmol NADH 为一个酶活力单位。
ADH(nmol/min/104 cell)=[(ΔA+0.0087)÷0.1019]÷(500×V1÷V)÷T=0.065×(ΔA+0.0087)
5、按液体体积计算：
定义：每毫升液体样本每分钟催化 1 nmolNAD+生成 1nmol NADH 为一个酶活力单位。
ADH(nmol/min/104 cell)=[(ΔA+0.0087)÷0.1019]÷V1÷T=32.7×(ΔA+0.0087)
V----加入提取液体积，1 mL；
V1----加入样本体积，0.02mL；
T----反应时间，15 min；
W----样本质量，g；
500----细菌或细胞总数，500 万。
Cpr----样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒；
附：标准曲线制作过程：
1 制备标准品母液（1nmol/μL）：向标准品 EP 管里面加入 1.41ml 蒸馏水（母液需在两
天内用且-20℃保存）。
2 把母液稀释成六个浓度梯度的标准品：0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5. nmol /μL。也可根据实
际样本来调整标准品浓度。
3 依据 20μL 标准品+170μL 试剂一+10μL 试剂四，混匀 5min 后于 450nm 处读取 A 值，
根据结果即可制作标准曲线。
文献和实验
