本试剂盒仅供科研使用
己糖激酶(hexokinase,HK)试剂盒说明书
(货号:WS0180W 微板法 96 样)
一、产品简介:
己糖激酶(HK,EC 2.7.1.1)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,是糖酵
解途径的限速酶之一。
己糖激酶磷酸化葡萄糖并产生 6-磷酸葡萄糖,该产物进一步与 6-磷酸葡萄糖脱氢酶和
NADP 偶联,在 340 nm 测 NADPH 光吸收增加量,进而计算出己糖激酶的活性。
二、试剂盒的组成和配制:
试剂名称
规格试剂名称 保存要求
备注
提取液
液体 120mL×1 瓶
4℃保存
试剂一
液体 20mL×1 瓶
4℃保存
试剂二
粉剂μg×1 支
-20℃保存
临用前甩几下或离心使粉剂落入底部,
再加 1.1mL 蒸馏水溶解备用。
试剂三
粉剂 mg×1 瓶
4℃保存
临用前甩几下或离心使粉剂落入底部,
再加 18mL 试剂一溶解备用。
三、所需的仪器和用品:
酶标仪、96 孔板、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。
四、己糖激酶(HK)活性测定:
建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验
样本和试剂浪费!
1、样本制备:
① 组织样本:
称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆。12000rpm,4℃离心 10min,取
上清,置冰上待测。
【注】:若增加样本量,可以按照组织质量(
g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例提取。
② 细菌/细胞样本:
先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液;
冰浴超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);
12000rpm,4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
【注】:若增加样本量,可按照细菌或细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例
进行提取。
③ 液体样本:直接检测。若浑浊,离心后取上清检测。
2、上机检测:
① 酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 340nm。
② 配置好的试剂二和三在 25℃预热 5min 至室温;
③ 在 96 孔板中依次加入:
试剂(
μL)
测定管
样本
20
试剂二
10
试剂三
170
混匀,1min 时于 340nm 处读取吸光值 A1,
21min(即 20min 后)读取 A2,△A=A2-A1。
【注】1.若△A 的值在零附近,可以适当延长反应时间到 30min 或更长读取 A2,改变后本试剂盒仅供科研使用
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的反应时间需代入计算公式重新计算。或适当加大样本量,则改变后的加样体
积 V1 需代入计算公式重新计算。
2. 若上升趋势不稳定,可以每隔 10S 读取一次吸光值,选取一段线性上升的时间
段来参与计算,相对应的 A 值也代入计算公式重新计算。
五、结果计算:
1、按样本蛋白浓度计算:
单位定义:每毫克组织蛋白每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
己糖激酶(HK) (nmol/min/mg prot)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(V1×Cpr) ÷T=160.77×ΔA÷Cpr
2、按样本鲜重计算:
单位定义:每 g 组织每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
己糖激酶(HK) (nmol/min/g 鲜重)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(W×V1÷V) ÷T=160.77×ΔA÷W
3、按细菌或细胞密度计算:
单位定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
己糖激酶(HK) (nmol/min/104 cell)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(500×V1÷V)÷T=0.32×ΔA
4、按液体体积计算:
单位定义:每毫升液体在每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
己糖激酶(HK) (nmol/min/mL)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷V1÷T=160.77×ΔA
ε---NADPH 摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm; d---96 孔板光径,0.5cm;
V---加入提取液体积,1 mL;
V1---加入样本体积,0.02 mL;
V2---反应体系总体积,2×10-4 L;
T---反应时间,20min;
W---样本质量,g;
500---细菌或细胞总数,500 万;
Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL;建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。