本试剂盒仅供科研使用
线粒体 H+ - ATP 酶活性测定说明书
（货号：WS3680W 微板法 48 样）
一、产品简介：
线粒体是细胞呼吸代谢的重要场所，位于线粒体内膜的 H+ -ATP 酶是氧化磷酸化偶
联的关键组分。H+ -ATP 酶可催化 ATP 水解生成 ADP 和无机磷，本试剂盒通过测定无
机磷的量来确定该酶活性高低。
二、试剂盒的组成和配制：
【注】：全程操作需无磷环境；试剂配置最好用新的枪头和玻璃移液器等，也可以用一次性塑料器皿，避
免磷污染。
三、所需的仪器和用品：
酶标仪、96 孔板、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。
四、线粒体 H+ -ATP 酶活性检测：
建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免
实验样本和试剂浪费！
1、线粒体制备（提示：整个线粒体的提取过程须保持 4℃低温环境）：
① 称取约 0.2g 组织或收集 1000 万细菌/细胞，加入 1mL 提取液 1，用冰浴匀浆器或研
钵冰浴匀浆，转移至离心管后于 4℃×3000g 离心 20min。
② 小心吸取上清液（弃沉淀）移至另一离心管中，4℃×16000g 离心 20min。用移液器
移除上清液（上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的 H+- ATP
酶（此步可选做））。留下沉淀（沉淀即为线粒体）。
③ 在沉淀（线粒体）中加入 200μL 提取液 2，超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，
超声 5s，间隔 3s，重复 30 次），液体置于冰上用于线粒体 H+- ATP 酶活性测定。
【注】：若增加样本量，可按照组织质量（
g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取，或按
照细菌/细胞数量（104）：提取液（mL）为 500~1000：1 的比例进行提取。
2、上机检测：
① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 740nm，所有试剂解冻至室温（25℃）。
试剂名称
规格
保存要求
备注
提取液 1
提取液 60mL×1 瓶
4℃保存
提取液 2
提取液 15mL×1 瓶
4℃保存
试剂一
液体 17mL×1 瓶
4℃保存
试剂二
粉剂×1 支
4℃保存
用前甩几下使试剂落入底部，再加
2.5mL 蒸馏水，混匀溶解备用。
试剂三
液体 3mL×1 支
4℃保存
试剂四
粉剂×1 支
4℃保存
用前甩几下使试剂落入底部，再加
2.5mL 蒸馏水，混匀溶解备用。
试剂五
粉剂×1 支
-20℃保存 用前甩几下使试剂落入底部，再加
0.7mL 蒸馏水，混匀溶解备用。
试剂六
液体 5mL×1 瓶
4℃保存
试剂七
A:粉体 mg×1 瓶
B:液体 1.5mL×1 瓶
4℃保存
临用前加 1.2 mL 的 B 液，再加 15.47
mL 的蒸馏水，混匀溶解备用。
标准品
粉体 mg×1 支
4℃保存
若重新做标曲，则用到该试剂。本试剂盒仅供科研使用
2
② 所有试剂解冻至室温（25℃）。
③ 在 EP 管中依
次加入：
④ 显色反应（在 96 孔板中操作）：
五、结果计算：
1、标准曲线方程：y = 1.1664x-0.0002，x 是标准品摩尔质量（μmol/mL）, y 是△A。
2、按蛋白浓度计算：
定义：每小时每毫克组织蛋白分解 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。
酶活力(μmol/h/mg prot)= [(△A+0.0002)÷1.1664×V2] ÷（V1×Cpr）÷T
=19.93×(△A+0.0002)÷Cpr
3、按样本鲜重计算：
定义：每小时每克组织分解 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。
酶活力(μmol/h/g 鲜重)=[(△A+0.0002)÷1.1664×V2]÷(W× V1÷V)÷T
=19.93×(△A+0.0002)÷W
4、按细菌或细胞密度计算：
定义：每小时每 1 万个细菌或细胞分解 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。
酶活力(μmol/h /104 cell)= [(△A+0.0002)÷1.1664×V2]÷(500×V1÷V)÷T=0.04×(△A+0.0002)
5、液体中酶活力计算:
定义：每小时每毫升液体分解 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。
酶活力（μmol/h/mL）=[(△A+0.0002)÷1.1664×V2]÷V1÷T=19.93×(△A+0.0002)
试剂名称（μL）
测定管
对照管
试剂一
140
150
试剂二
20
20
试剂三
30
30
试剂四
20
20
样本
40
40
混匀，静置 5min
试剂五
10
混匀，37℃孵育 20min
试剂六
50
50
混匀，12000rpm，4℃离心 5min，上清液待测
上清液
100
100
试剂七
150
150
混匀，室温静置 15min，740nm 下读取各管吸光值，
△A=A 测定-A 对照（每个样本做一个自身对照）。本试剂盒仅供科研使用
3
V---加入提取液体积，1mL；
V1---加入样本体积，0.04mL ；
V2---酶促反应总体积，0.31mL；
T---反应时间，1/3 小时；
W---样本鲜重，g；
500---细菌或细胞总数，500 万；
Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的蛋白含量检测试剂盒。
附：标准曲线制作过程：
1 制备标准品母液（5μmol/mL）：标准品用 10mL 蒸馏水溶解。（母液需在两天内用）。
2 把母液稀释成九个浓度梯度的标准品：0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5μmol/mL。也可根据实
际样本来调整标准品浓度。
3 依据显色反应阶段测定管的加样体系操作，根据结果即可制作标准曲线。
文献和实验
技术资料