本试剂盒仅供科研使用
NAD-苹果酸脱氢酶（NAD-MDH）试剂盒说明书
（货号：WS1280F 分光法 48 样）
一、产品简介：
苹果酸脱氢酶广泛存在于动植物、微生物和培养细胞中，依据需要的辅酶不同，可分为：
NAD-MDH和NADP-MDH，前者主要存在于线粒体和胞质中，后者存在于某些微生物和
植物叶绿体中；苹果酸脱氢酶与多条生理代谢途径密切相关：线粒体的能量代谢、 苹果
酸-天冬氨酸穿梭系统、活性氧代谢和抗病性等。
NAD-MDH（EC 1.1.1.37）催化 NADH 还原草酰乙酸生成苹果酸，使 NADH 在 340nm
处光吸收下降，进而通过 340nm 处光吸收的下降速率计算得到 NAD-MDH 的酶活性大小。
二、试剂盒的组成和配制：
试剂名称
规格
保存要求
备注
提取液
液体 60mL×1 瓶
4℃保存
试剂一
粉剂×2 支
-20℃保存
临用前甩几下或离心使试剂落到底
部，再加 1.8mL 蒸馏水溶解，用不完
的试剂分装后
-20℃
保存，禁止反复冻
融，三天内用完。
试剂二
液体 35mL×1 瓶
4℃保存
试剂三
粉剂×2 支
-20℃保存
临用前甩几下或离心使试剂落到底
部，再加 1.8mL 蒸馏水溶解，三天内
用完。
三、所需的仪器和用品：
紫外分光光度计、1mL 石英比色皿（光径 1cm）、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、
蒸馏水。
四、NAD-苹果酸脱氢酶（NAD-MDH）活性测定：
建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验
样本和试剂浪费！
1、样本制备：
① 组织样本：
称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆。12000rpm 4℃离心 10min，取上
清，置冰上待测。
【注】：若增加样本量，可按照组织质量（
g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例提取
② 细菌/细胞样本：
先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液；
超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；
12000rpm 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。（或按照细菌或细胞数量（104个）：提
取液体积（mL）为 1000~2000：1 的比例进行提取）
【注】：若增加样本量，可按细菌/细胞数量（104个）：提取液（mL）为 1000~5000：1 的比例进行提取
③ 液体样本：直接检测。若浑浊，离心后取上清检测。
2、上机检测：
1 紫外分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。
2
测定前将溶好的试剂一在 25℃水浴锅中孵育 10min 以上。
3 在 1mL 石英比色皿中依次加入：本试剂盒仅供科研使用
2
试剂名称（μL）
测定管
样本
40
试剂一
60
试剂二
640
试剂三
60
混匀，30℃下立即于 340nm 下读取 A1，
1min 后读取 A2，ΔA=A1-A2。
【注】1.若△A 在零附近，可延长反应时间 T（如增至 10min）读取 A2；或加大样本量 V1（如增至
80μL，则试剂二相应减少）。改变后的反应时间 T 或 V1 需代入公式重新计算。
2. 若△A 大于 0.6 或 A2 的值小于 0.5，需缩短反应时间时间 T（如减至 0.5min），或减少样本
量 V1（如减至 10μL，则试剂二相应增加），则改变后的 T 和 V1 需代入公式重新计算。
3. 若起始值 A1 太大如超过 2（颜色较深的植物叶片，一般色素较高则起始值相对会偏高），
可减少 V1（如减至 10μL，则试剂二相应增加），则改变后的 V1 代入公式重新计算。
或向待测样本中加少许活性炭混匀静置 5min 后 12000rpm, 4℃离心 10min，上清液用于检测；
4. 若下降趋势不稳定，可以每隔 10S 读取一次吸光值，选取一段线性下降的时间段来参与计
算，相对应的 A 值也代入公式重新计算。
五、结果计算：
1、按样本蛋白浓度计算：
酶活定义：每毫克组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
NAD-MDH（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V2÷（ε×d）×109]÷(V1×Cpr) ÷T=3215.4×ΔA÷Cpr
2、按样本鲜重计算：
酶活定义：每克组织中每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
NAD-MDH（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V2÷（ε×d）×109]÷（W× V1÷V）÷T =3215.4×ΔA÷W
3、按细菌/细胞密度计算：
酶活定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
NAD-MDH（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V2÷（ε×d）×109]÷（500×V1÷V）÷T=6.43×ΔA
4、按液体体积计算：
酶活定义：每毫升液体每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
NAD-MDH（nmol/min/mL）=[ΔA×V2÷（ε×d）×109]÷V1÷T=3215.4×ΔA
ε---NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；
d---96 孔板光径，1cm；
V---加入提取液体积，1 mL；
V1---加入样本体积，0.04mL；
V2---反应体系总体积，8×10-4 L；
T---反应时间，1min；
500---细胞或细菌总数，500 万。
W---样本质量，g；
Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。
文献和实验
