本试剂盒仅供科研使用
山梨醇氧化酶(SOX)测定试剂盒说明书
(货号:WS2750F 分光法 24 样)
一、产品简介:
山梨醇作为一种运输糖,被卸载到果实中时转化成其他糖类物质,山梨醇氧化酶
(sorbitol oxidase,SOX)就是山梨醇转化和利用过程中的关键酶之一,该酶与果实的
品质以及果实中糖类物质的积累密切相关。
山梨醇氧化酶(SOX)催化山梨醇生成葡萄糖,葡萄糖进一步与 3,5-二硝基水杨酸
反应,生成棕红色氨基化合物,经光谱扫描在 540nm 有特征光吸收,在一定范围内 540nm
光吸收增加速率与山梨醇氧化酶(SOX)活性成正比。
二、试剂盒的组成和配制:
试剂名称
规格
保存要求
备注
提取液
液体 30mL×1 瓶
4℃保存
试剂一
液体 7mL×1 瓶
4℃保存
试剂二
粉剂 mg×1 支
4℃保存
用前加入 1.5mL 蒸馏水充分溶解
备用;用不完的试剂 4℃保存;
试剂三
液体 10mL×1 瓶
4℃保存
标准品
粉体 mg×1 支
4℃保存
若重新做标曲,则用到该试剂
三、所需的仪器和用品:
可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿(光径 1cm)、低温离心机、水浴锅、可调式移液器、
研钵、冰和蒸馏水。
四、山梨醇氧化酶(SOX)活性测定:
建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验
样本和试剂浪费!
1、样本制备:
称样本 0.1g(水分充足的样本可取 0.5g)于研钵中,加入 1mL 提取液,冰浴匀浆后
转入离心管中。12000rpm,4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
【注】:若增加样本量,可按照组织质量(
g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例进行提取
2、上机检测:
1 可见分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 540nm,蒸馏水调零。
2 在 EP 管中依次加入:
试剂名称(μL)
测定管
对照管
样本
40
40
试剂一
120
160
试剂二
40
混匀,30℃(水浴锅或恒温培养箱)下孵育 30min
试剂三
200
200
混匀,沸水浴(95-100℃)(可用封口膜缠紧 EP 管)5min,
流水冷却
蒸馏水
400
400
混匀,全部澄清液体转入 1mL 玻璃比色皿中,于 540nm 处读取
吸光值 A,△A=A 测定-A 对照(每个样本自身需做一个自身对照)。本试剂盒仅供科研使用
2
【注】:1.若吸光值大于 2,可减少样本加样量 V1(如减至 20μL,则试剂一相应增加),则改
变后的加样体积 V1 需代入计算公式重新计算。
2.若ΔA 值在零附近徘徊,可延长 30℃水浴时间(如增至 60min),则改变后的反应时间 T
需代入公式重新计算。
五、结果计算:
1、标准曲线方程为 y = 0.0104x-0.0496;x 为标准品质量(μg),y 为ΔA。
2、按蛋白浓度计算:
单位定义:37℃每毫克蛋白每分钟产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活性单位。
山梨醇氧化酶(SOX)(μg/min/mg prot)=[(ΔA+0.0496) ÷0.0104]÷(V1×Cpr ) ÷T
=80.1×(ΔA+0.0496) ÷Cpr
3、按鲜重计算:
单位的定义:37℃每克组织每分钟产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活性单位。
山梨醇氧化酶(SOX)(μg/min/g 鲜重)=[(ΔA+0.0496) ÷0.0104]÷(W×V1÷V) ÷T
=80.1×(ΔA+0.0496)÷W
V----加入提取液体积,1mL; V1----加入反应体系中样本体积,0.04mL;
T----反应时间,30min;
W----样本鲜重,g;
Cpr----样本蛋白质浓度,mg/mL;建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒;
附:标准曲线制作过程:
1 制备标准品母液(3mg/mL):向标准品 EP 管里面加入 1mL 蒸馏水(母液需在两天
内用且-20℃保存)。
2 把母液稀释成六个浓度梯度的标准品:0, 0.6, 1.2, 1.8, 2.4, 3. mg/mL。也可根据实际
样本来调整标准品浓度。
3 按照测定管的加样顺序依次加样操作,根据结果即可制作标准曲线。