Biotin RNA Labeling Kit (SP6/T

碧云天研发生产的Biotin RNA Labeling Kit (SP6/T7)，即RNA生物素标记试剂盒(SP6/T7)，是一种通过高效的SP6 RNA polymerase或T7 RNA polymerase进行体外转录，从而获得生物素标记的RNA探针的试剂盒。本试剂盒可以配合质粒pRNA-SP6-T7 (RNA体外转录质粒) (D2314)或其它在多克隆位点两侧有SP6或T7 promoter的质粒，在多克隆位点插入目的基因并线性化后使用。

本试剂盒的工作原理是利用带有SP6 Promoter (ATTTAGGTGACACTATAG)或T7 Promoter (TAATACGACTCACTATAGGG)的线性化质粒、PCR产物或合成的DNA片段等为模板，利用SP6 RNA Polymerase或T7 RNA Polymerase能在相对较短的时间内进行体外RNA转录的特性，以Biotin-16-UTP部分取代UTP，从而转录生成生物素标记的RNA探针[1]。

Biotin-16-UTP (Biotin-16-uridine-5'-triphosphate, 即生物素-16-尿苷-5'-三磷酸)是UTP (Uridine-5'-triphosphate, 即尿苷-5'-三磷酸)的生物活性类似物，在体外转录反应中很容易被SP6或T7 RNA Polymerase作为转录反应底物整合到RNA中[2]。由于使用的RNA Polymerase对天然核苷酸(Nucleoside triphosphate, NTP)和生物素标记核苷酸(Biotin-NTP)没有选择倾向性，因此每个RNA转录产物生物素标记的程度可以通过调节转录反应中NTP与Biotin-NTP的比例来控制。本试剂盒将Biotin-16-UTP的比例控制在约35%，使反应和标记效率之间达到较好的平衡。

碧云天Biotin RNA Labeling Kit (SP6/T7)以带有SP6或T7 Promoter的线性化质粒DNA为模板进行转录时的产量参考图1。本试剂盒在标准的RNA转录反应条件下，在20μl的反应体系中，使用1μg的线性化DNA模板(长度约3kb)，37℃孵育2小时，转录产物长度约为500nt时，可合成约8-10μg生物素标记的RNA。合成的标记RNA的数量取决于模板DNA的数量、纯度以及转录产物的长度。进一步延长孵育时间并不会增加生物素标记RNA的产量，但可以通过按比例放大反应体系，获得更多的生物素标记RNA。

图1.碧云天Biotin RNA Labeling Kit (SP6/T7) (R7061)的产量参考图。带有SP6 Promoter的线性化质粒DNA模板在SP6 RNA Polymerase作用下进行的转录(图A)；带有T7 Promoter的线性化质粒DNA模板在T7 RNA Polymerase作用下进行的转录(图B)。在20µl反应体系中，通过使用1.0μg 3199bp的线性化质粒DNA为模板，在37℃分别孵育0、15、30、60、120、240分钟，随后70℃孵育10分钟终止反应；加入2μl DNase I, RNase-free (1U/µl)，37℃孵育30分钟消化模板DNA，得到生物素标记的RNA转录产物长度为496nt；用苯酚/氯仿抽提以及乙醇沉淀并用超微量紫外分光光度计检测得到的RNA产物量。实际产量会因具体实验条件的不同而产生差异，本图仅供参考。

使用本试剂盒获得的RNA探针应用范围广。本试剂盒转录合成的带生物素标记的RNA探针可用于Northern、Southern、原位杂交、RNase保护实验(RNase Protection Assay)等相关研究。

本试剂盒标记的RNA探针后续兼容多种检测方法。本试剂盒转录合成的带有生物素标记的RNA探针可以使用荧光基团、酶或抗体偶联的链霉亲和素(Streptavidin)进行检测。推荐使用辣根过氧化物酶标记Streptavidin (A0303或A0305)与DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒(P0202/P0203)或BeyoECL Moon (P0018F)联合使用进行检测，或者使用碱性磷酸酯酶标记Streptavidin (A0312)与BCIP-NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒(C3206)联合使用进行检测。后者的检测效果请参考图2。

图2.碧云天Biotin RNA Labeling Kit (SP6/T7) (R7061)转录合成生物素标记的RNA探针的检测效果图。在20µl反应体系中，通过使用1.0μg 3199bp的线性化质粒DNA为模板，在37℃孵育2小时；随后加入2μl DNase I (1U/µl)，37℃孵育30分钟消化模板DNA，得到生物素修饰的RNA转录产物；用苯酚/氯仿抽提以及乙醇沉淀纯化RNA产物，用超微量紫外分光光度计检测得到的RNA产物浓度。取适量体积的反应产物(样品中RNA含量分别为800、600、400、200和100ng)滴至尼龙膜(FFN13)上，待样品风干后，进行紫外交联；用Wash Buffer (0.1% Tween-20 in 1X PBS)洗涤3分钟，洗去未结合至膜上的RNA，再用Blocking Buffer (5% Non-fat milk in Wash Buffer)室温封闭1小时。将膜转移至碱性磷酸酯酶标记Streptavidin (A0312)的稀释液中，室温孵育2小时(或4℃孵育过夜)；孵育结束后用Wash Buffer室温洗涤3-5次，每次5分钟；随后将洗涤过的尼龙膜浸泡在BCIP/NBT碱性磷酸酯酶染色工作液(C3206)中，室温避光孵育3-5分钟，直至显色至预期深浅；用蒸馏水室温洗涤1-2次，每次5分钟，终止显色反应，最后使用BeyoImager™ 600化学发光成像系统记录化学发光效果。实验结果显示，与未进行生物素标记的RNA探针相比，使用本试剂盒生成的RNA探针能明显检测到生物素的存在，表明生物素成功标记在RNA上。图中检测效果仅供参考，不同的实验条件获得的检测效果可能会略有不同。

一个小包装的本试剂盒(R7061S)可以进行20个20μl体系的体外反转录反应；一个中包装的本试剂盒(R7061M)可以进行100个20μl体系的体外反转录反应。本试剂盒提供的试剂用于基于SP6或T7 promoter的RNA生物素标记都是足量的。

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
R7061S-1	Nuclease-free Water	0.5ml
R7061S-2	NTP Labeling Mix (10X)	40μl
R7061S-3	Transcription Buffer (10X)	40μl
R7061S-4	SP6 Control Template (0.5µg/µl)	6μl
R7061S-5	T7 Control Template (0.5µg/µl)	6μl
R7061S-6	SP6 RNA Polymerase	40μl
R7061S-7	T7 RNA Polymerase	40μl
R7061S-8	RNase Inhibitor	10μl
R7061S-9	DNase I	40μl
—	说明书	1份

 

产品编号	产品名称	包装
R7061M-1	Nuclease-free Water	2ml
R7061M-2	NTP Labeling Mix (10X)	200μl
R7061M-3	Transcription Buffer (10X)	200μl
R7061M-4	SP6 Control Template (0.5µg/µl)	20μl
R7061M-5	T7 Control Template (0.5µg/µl)	20μl
R7061M-6	SP6 RNA Polymerase	200μl
R7061M-7	T7 RNA Polymerase	200μl
R7061M-8	RNase Inhibitor	50μl
R7061M-9	DNase I	200μl
—	说明书	1份

保存条件：

-20℃保存，至少一年有效。

注意事项：

本试剂盒内所有试剂保存在-20℃，并尽量避免反复冻融。

所有试剂使用前请进行快速离心使液体沉降至管底后再开启使用。

需要自备的试剂：预冷无水乙醇、预冷70%乙醇、RNA纯化及其它相关的实验试剂耗材。

由于涉及RNA操作，请严格按照RNA操作的规范进行，避免RNase污染，相关试剂和耗材需要经过DEPC处理以去除RNase或者确保是RNase free的。

本试剂盒的反应体系通常为20µl，但可根据实际需求按比例放大反应体系。

建议尽量提高转录模板的质量和纯度，以保证生物素标记RNA的产量。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。