本试剂盒仅供科研使用
天冬酰胺酶(Asparaginase, ASNase) 活性测定试剂盒说明书
(货号：WS5340F 分光法 48 样)
一、产品简介：
天冬酰胺酶（EC 3.5.1.1，ASNase）是一种酰胺水解酶，能够将 L-天冬酰胺脱去氨基
生成 L-天冬氨酸和氨。该酶具有抗肿瘤活性，在食品和医药等领域应用十分广泛。
天冬酰胺酶（ASNase）催化天冬酰胺水解成天冬氨酸和氨，利用氨在强碱的环境下与
次氯酸盐和苯酚作用，生成水溶性染料靛酚蓝，溶液颜色稳定。其在 630nm 处有特征吸
收峰，通过检测氨增加的速率，即可计算该酶活性大小。
二、试剂盒的组成和配制：
试剂名称
规格
保存要求
备注
提取液
液体 60mL×1 瓶
4℃保存
试剂一
液体 20mL×1 瓶
4℃保存
试剂二
粉剂 mg×2 瓶
4℃保存
临用前甩几下使粉体落入底部，每瓶再加
11mL 蒸馏水溶解备用。
试剂三
液体 20mL×1 瓶
4℃保存
试剂四
液体 24mL×1 瓶
4℃保存
试剂五
液体 12mL×1 瓶
4℃保存
试剂六
A：液体 7mL×4 瓶
B：液体μL×1 支
4℃保存
临用前取 60μL 的 B 液进一瓶 A 液中，混
匀后作为试剂六使用。混匀后的试剂六一
周内用完。
标准管
液体 mL×1 支
4℃保存
若重新做标曲，则用到该标曲。
三、所需的仪器和用品：
可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿（光径 1cm）、台式离心机、可调式移液枪、研钵。
四、天冬酰胺酶（ASNase）活性测定：
1、样本制备：
① 组织样本：称取约 0.1g 组织（水分足的样本可取 0.2-0.5g），加入 1mL 提取液；进行
冰浴匀浆。12000rpm，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
【注】：也可以按照组织质量（
g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例提取。
② 细菌/细胞样本：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约 500 万细菌或细
胞加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 200W，超声 3s，间隔 10s，
重复 30 次）；12000rpm 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（104）：提取液（mL）为 500~1000：1 的比例进行提取。
③ 液体样本：直接检测；若浑浊，离心后取上清检测。
2、上机检测：
① 分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 630nm，蒸馏水调零。
② 所有试剂解冻至室温（25℃），在 EP 管依次加入：
试剂名称（
μL）
测定管
对照管
样本
80
80
试剂一
200
200
试剂二
200
试剂三
200
混匀，放入 37℃水浴锅或恒温培养箱中孵育 1h
试剂二
200本试剂盒仅供科研使用
2
试剂三
200
混匀，室温 12000rpm 离心 10min，上清液待测。
③ 显色反应：在 EP 管中依次加入：
试剂名称（
μL）
测定管
对照管
上清液（上步反应）
60
60
蒸馏水
180
180
试剂四
240
240
试剂五
120
120
试剂六
240
240
充分混匀，37℃放置 20min 后，全部液体转移至 1mL 玻璃比色皿（光
径 1cm）中，于 630nm 处读取吸光值 A，
ΔA=A 测定管-A 对照管（每个样本做一个自身对照）。
【注】1. 试剂四和五和六需分开加，不能事先混匀。
2. 若ΔA 的值较小，可增加 37℃孵育时间（如增至 2 小时或更长），或在显色阶段增加上清液量
V1(如增至 120μL，则蒸馏水体积相应减少)；则改变后的 T 和 V1 需代入计算公式重新计算。
3. 若 A 测定大于 1.8，可减少 37℃孵育时间（如减至 0.5 小时或更短），或在显色阶段减少上清
液量 V1(如减至 30μL，则蒸馏水体积相应增加)；则改变后的 T 和 V1 需代入公式重新计算。
五、结果计算：
1、标准曲线方程为 y = 1.2921x - 0.0071；x 为标准品质量（
μg），y 为吸光值ΔA。
2、按样本蛋白浓度计算：
单位定义：每毫克蛋白质每小时催化天冬酰胺生成 1μg 氨定义为一个酶活力单位。
ASNase(μg/h/mg prot)=(ΔA+0.0071)÷1.2921×(V2÷V3)÷(V1×Cpr)÷T=110×(ΔA+0.0071)÷Cpr
3、按样本鲜重计算：
单位定义：每克组织每小时催化天冬酰胺生成 1μg 氨定义为一个酶活力单位。
ASNase(μg/h/g 鲜重)=(ΔA+0.0071)÷1.2921×(V2÷V3)÷(W×V1÷V)÷T=110×(ΔA+0.0071)÷W
4、按细胞数量计算：
单位定义：每 104个细胞每小时催化天冬酰胺生成 1μg 氨定义为一个酶活力单位。
ASNase(μg/h/104 cell)=(ΔA+0.0071)÷1.2921×(V2÷V3)÷(500×V1÷V)÷T=0.22×(ΔA+0.0071)÷W
5、按照液体体积计算：
单位定义：每毫升液体每小时催化天冬酰胺生成 1μg 氨定义为一个酶活力单位。
ASNase (μg/h/mL)=(ΔA+0.0071)÷1.2921×(V2÷V3)÷V1÷T=110×(ΔA+0.0071)÷W
V---提取液体积，1mL；
V1----加入②歩反应体系中样本体积，0.08mL；
V2---②歩反应体系总体积：0.68mL；
V3---③歩显色步骤中上清液体积，0.06mL；
T---反应时间，1h；
W---样本质量；
Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL，建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。
附：标准曲线制作过程：
1 标准品母液（10μg/mL 的氨），把母液用蒸馏水稀释成以下浓度梯度的标准品：0, 2, 4,
6, 8, 10 μg/mL。也可根据实际样本来调整标准品浓度。
2 按照显色反应阶段的测定管加样体系操作，根据结果即可制作标准曲线。
文献和实验
