本试剂盒仅供科研使用
中性蛋白酶（Neutral protease, NPT）试剂盒说明书
（货号：WS4140W 微板法 48 样）
一、产品简介：
蛋白酶广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中，中性蛋白酶（NPT）是在中性条件下将酪
蛋白水解产生酪氨酸；酪氨酸与福林酚在碱性条件下反应生成蓝色化合物；该蓝色物质在 680nm 有特征
吸收峰，进而得中性蛋白酶活性，
由于底物酪蛋白自身含有多种氨基酸，所以在检测过程中必须设置带有底物酪蛋白的对照，以扣除有
干扰的背景值，排除假阳性。
二、测试盒组成和配制：
试剂名称
规格试剂名称
保存要求
备注
提取液
液体 120mL×2 瓶
4℃保存
试剂一
粉剂 mg×2 瓶
4℃保存
用前甩几下或 4℃离心使试剂落入试管底部，
每瓶加入 3mL 试剂二 90℃加热搅拌至分散，
再加 12mL 提取液搅拌至溶解，最后再加提
取液定容至 30mL,继续搅拌至全部溶解；配
置完的试剂 4℃保存，三天内用完。
试剂二
液体 10mL×1 瓶
4℃保存
用前摇匀
试剂三
液体 50mL×1 瓶
4℃保存
用前摇匀
试剂四
液体 40mL×1 瓶
4℃保存
用前摇匀
试剂五
液体 10mL×1 棕色瓶
4℃保存
现用现配，用前甩几下或 4℃离心使试剂落入
试管底部，再加 20mL 蒸馏水， 4℃保存，
一星期内用完。
标准品
粉体 mg×1 支 EP
4℃保存
若重新做标曲，则用到该试剂。
【注】：试剂一若在磁力搅拌器（带温控）上溶解，可用锡箔纸或保鲜膜盖住烧杯，以免溶解过程中水分蒸发过快。
三、所需的仪器和用品：
酶标仪、96 孔板、水浴锅、磁力搅拌器、可调式移液枪、蒸馏水
四、中性蛋白酶（NPT）活性测定：
建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！
1、样本制备：
① 组织样本：测定管和对照管分别取约 0.1g 组织（水分充足的果实约 0.5g），加入 1mL 提
取液，进行冰浴匀浆；12000rpm，4℃离心 15min；取上清液待测。
【注】：若增加样本量，可按照组织质量（
g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取
② 细菌/真菌样本：测定管和对照管分别取约 500 万细胞加入 1mL 提取液，冰浴超声波破
碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；12000rpm，4℃离心 15min；
取上清液待测。
【注】：若增加样本量，按细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 比例进行提取
③ 液体样本：澄清液体直接检测；若浑浊则 12000rpm，4℃离心 15min；上清待测。
2、上机检测：
① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 680nm，配制好的试剂一需预先 50℃水浴 10min。
② 在 2mL 离心管中依次加入下列试剂培养：
试剂名称（
μL）
测定管
对照管
样本
500
500
试剂一
500
40℃振荡培养 10min，同时，余下的试剂一须单独 40℃振荡培养 10min本试剂盒仅供科研使用
2
上歩单独 40℃培养的试剂一
500
试剂三
500
500
混匀，室温静置 10min，1500rpm（须准确），4℃离心 10min，上清液待用
③ 显色反应：在 EP 管中依次加入：
上清液
250
250
试剂四
375
375
试剂五
250
250
40℃水浴 20min，取 200μL 澄清液（若浑浊，可 1500rpm 离心 10min）
至 96 孔板中，于 680nm 读取吸光值 A，△A=A 测定管-A 对照管。
【注】1.若△A 在零附近徘徊，可以加大样本量（如增加到 0.2g），或延长 40℃培养时间（如增加至
30min），或在显色反应阶段加大上清液体积（如，增加至 350μL，则试剂五相应减少），则改
变后的样本质量 W，反应时间 T 和显色步骤中的上清液体积 V1 需代入公式重新计算。
2.若测定管的 A 值大于 1.5，可减少样本取样量（如减少到 0.05g），或把上清液用蒸馏水进行稀
释，稀释倍数 D 代入公式参与计算。
五、结果计算：
1、标准曲线方程：y = 0.0626x + 0.0011，x 是标准品质量（
μg），y 是ΔA。
2、按照蛋白浓度计算：
活性单位定义：40℃每毫克蛋白每分钟催化水解产生 1μg 酪氨酸为 1 个酶活单位。
NPT 活性(μg/min/mg prot)=(ΔA-0.0011)÷0.0626×(V3÷V2)÷(Cpr×V1÷V)÷T×D
=19.2×(ΔA-0.0011) ÷Cpr×D
3、按照样本质量计算：
活性单位定义：40℃每克样品每分钟催化水解产生 1μg 酪氨酸为 1 个酶活单位。
NPT 活性(μg/min/g 鲜重)=(ΔA-0.0011) ÷0.0626×(V3÷V2)÷(W×V1÷V)÷T×D
=19.2×(ΔA-0.0011) ÷W×D
4、按照细胞数量计算：
活性单位定义：40℃每 104个细胞每分钟催化水解产生 1μg 酪氨酸为 1 个酶活单位。
NPT 活性(μg/min/104 cell)=(ΔA-0.0011) ÷0.0626×(V3÷V2)÷(细胞数量×V1÷V)÷T×D
=19.2×(ΔA-0.0011)÷细胞数量×D
5、按液体体积计算：
活性单位定义：40℃每毫升液体样本每分钟催化水解产生 1μg 酪氨酸为 1 个酶活单位。
NPT 活性(μg/min/mL)=(ΔA-0.0011) ÷0.0626×(V3÷V2)÷V4÷T×D =19.2×(ΔA-0.0011) ×D
V---提取液体积，1mL；
V1---样本体积，0.5mL； V2---显色步骤上清液体积，0.25mL；
V3---培养步骤总反应体积，1.5mL； V4---液体样本，0.5mL； 酪氨酸分子量---181.19；
T---反应时间，10min；
W---样本质量，g；
D---稀释倍数，未稀释即为 1；
Cpr---粗酶液蛋白质浓度（mg/mL），建议使用本公司的 BCA 蛋白质含量测定试剂盒检测。
附：标准曲线制作过程：
1
标准品母液（100μg/mL）：标准品溶于 100mL 的 0.1mol/L 盐酸溶液中（两天内用完且-20℃保存）。
2
把母液稀释成六个浓度梯度标准品：0, 4, 8, 12, 16, 20. μg/mL。也可根据实际来调整标准品浓度。
3 依据测定管的显色反应阶段加样表依次加样，根据结果即可制作标准曲线。
文献和实验
