果胶裂解酶测试盒（微量法）

果胶裂解酶（pectinate lyases，PL）试剂盒说明书
                                          微量法100T/48S

注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
果胶裂解酶（EC4.2.2.10）是果胶酶的重要组成部分，是一种能降解植物细胞壁，导致植物组织软化甚至死亡的解聚酶，来源比较广泛，主要来源于微生物，可用于果汁、果酒的澄清，提高水果出汁率，植物病毒的纯化，纸浆的漂白和纺织品的生物精炼，在减少环境污染和降低能源消耗方面具有潜在的应用价值。

测定原理：
果胶裂解酶作用于果胶中的α-1,4糖苷键，生成在还原端C4和C5之间位置具有不饱和键的不饱和寡聚半乳糖醛酸，在235nm处有特征吸收峰。

自备实验用品及仪器：
天平、低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、恒温水浴锅。

试剂组成和配制：
提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体6mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：液体6mL×1瓶，4℃保存。
试剂三：液体6mL×1瓶，4℃保存。

酶液提取：
1．组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。10000g ，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2．细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
3. 培养液：直接测定。
测定操作表：

1. 分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长至235nm，蒸馏水调零。
2. 操作表

	对照管	测定管
试剂一（μL）		120
试剂二（μL）	120
40℃温育3min
酶液（μL）	20	20
混匀，40℃反应30min
试剂三（μL）	60	60
混匀于微量石英比色皿/96孔板（UV板）测定235nm处吸光值A，△A=A测定管-A对照管。

酶活性计算公式：

1. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1. 组织中PL活性
（1）按照蛋白浓度计算
酶活性定义：在40℃，pH5.5条件下，每毫克蛋白每分钟分解果胶产生1nmol不饱和半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位。
PL活性（nmol/min/mg prot）= △A÷（ε×d）×V反总÷（V样×Cpr）÷T
= 64.1×△A÷Cpr
（2）按照样本质量计算
酶活性定义：在40℃，pH5.5条件下，每克组织每分钟分解果胶产生1nmol不饱和半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位。
PL活性（nmol/min/g 鲜重）= △A÷（ε×d）×V反总÷（V样×W÷V样总）÷T
= 64.1×△A÷W
2. 细菌、真菌PL活性
酶活性定义：在40℃，pH5.5条件下，每10⁴个细胞每分钟分解果胶产生1nmol不饱和半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位。
PL活性（nmol/min/10⁴cell）= △A ÷（ε×d）×V反总÷（V样×细胞数量÷V样总）÷T 
 = 64.1×△A÷细胞数量
3. 培养液PL活性
酶活性定义：在40℃，pH5.5条件下，每毫升培养液每分钟分解果胶产生1nmol不饱和半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位。
PL活性（nmol/min/mL）= △A÷（ε×d）×V反总÷V样÷T
= 64.1×△A
ε：不饱和半乳糖醛酸摩尔消光系数：5200L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应总体积，0.2mL；V样：反应体系中样本体积，0.02mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W，样本质量，g；T：反应时间，30min
 

1. 用96孔板测定的计算公式如下

1. 组织中PL活性
（1）按照蛋白浓度计算
酶活性定义：在40℃，pH5.5条件下，每毫克蛋白每分钟分解果胶产生1nmol不饱和半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位。
PL活性（nmol/min/mg prot）= △A÷（ε×d）×V反总÷（V样×Cpr）÷T
= 128.2×△A÷Cpr
（2）按照样本质量计算
酶活性定义：在40℃，pH5.5条件下，每克组织每分钟分解果胶产生1nmol不饱和半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位。
PL活性（nmol/min/g 鲜重）= △A÷（ε×d）×V反总÷（V样×W÷V样总）÷T
= 128.2×△A÷W
2. 细菌、真菌PL活性
酶活性定义：在40℃，pH5.5条件下，每10⁴个细胞每分钟分解果胶产生1nmol不饱和半乳糖醛酸所需的

酶量为一个酶活力单位。
PL活性（nmol/min/10⁴cell）=△A÷（ε×d）×V反总÷（V样×细胞数量÷V样总）÷T 
    = 128.2×△A÷细胞数量
3. 培养液PL活性
酶活性定义：在40℃，pH5.5条件下，每毫升培养液每分钟分解果胶产生1nmol不饱和半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位。
PL活性（nmol/min//mL）= △A÷（ε×d）×V反总÷V样÷T
= 128.2×△A
ε：不饱和半乳糖醛酸摩尔消光系数：5200L/mol/cm；d：比色皿光径，0.5cm；V反总：反应总体积，0.2mL；V样：反应体系中样本体积，0.02mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W，样本质量，g；T：反应时间，30min