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- xybio
- XY-sh0753
- 上海
- 2025年07月28日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 库存：
100
- 英文名：
/
- 保质期：
3个月
- 供应商：
上海烜雅生物科技有限公司
- 保存条件：
详见说明书
- 规格：
50管/24样
分光光度法50管/24样
注 意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
糖原磷酸化酶（Glycogen phosphorylase，GP，EC 2.4.1.1)）是糖原分解代谢的关键酶，使糖原分子从非还原端逐个断开α-1，4-糖苷键移去葡萄糖基，释放1-磷酸葡萄糖，直至临近糖原分子α-1，6-糖苷键分支点前4个葡萄糖基处。GP分为有活性的糖原磷酸化酶a（GPa）和无活性的糖原磷酸化酶b（GPb）两种形式。GPb在一定浓度的腺苷酸（5，-AMP）存在下可被激活。
测定原理：
GP催化糖原和无机磷产生葡萄糖残基生成糖原和1-磷酸葡萄糖，磷酸葡萄糖变位酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步依次催化NADP还原生成NADPH，在340nm下测定NADPH上升速率，即可反映GP活性。添加一定浓度的腺苷酸（5，-AMP）时测定GP（GPa和GPb）活性，未添加腺苷酸（5，-AMP）时测定GPa活性，GP活性－GPa活性得到GPb活性。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制：
提取液：60mL×1瓶，4℃保存；
试剂一：液体40 mL×1瓶， 4℃保存；
试剂二：粉剂×1瓶，-20℃保存；
试剂三：粉剂×1支，-20℃保存；
试剂四：粉剂×1支， -20℃保存；
试剂五：粉剂×1支， -20℃保存；
样本的前处理：
按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
测定步骤：
- 分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零；
- 工作液的配制：临用前将试剂二转移到试剂一中混合溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
- 试剂三的配制：临用前在试剂三瓶中加入2.5mL蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
- 试剂四的配制：临用前在试剂四瓶中加入2.5mL蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
- 试剂五的配制：临用前在试剂五管中加入1.25mL蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
- 将工作液、试剂三、试剂四和试剂五置于37℃预热5分钟；
- 1mL石英比色皿中加入50μL样本、50μL试剂三、50μL试剂四、50μL蒸馏水和800μL工作液，立即混匀，记录340nm处5min后的A1和10min后的吸光值A2，计算ΔAGPa=A2-A1。
- 在1mL石英比色皿中加入50μL样本、50μL试剂三、50μL试剂四、50μL试剂五和800μL工作液，立即混匀，记录340nm处5min后的A3和10min后的吸光值A4，计算ΔAGP=A4-A3。
GPb活性计算：
（1）按样本蛋白浓度计算
单位定义：每mg组织蛋白每分钟产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
GPb（nmol/min/mg prot）＝[(ΔAGP－ΔAGPa)×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=643×(ΔAGP－ΔAGPa)÷Cpr
（2）按样本鲜重计算
单位定义：每g组织每分钟产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
GPb（nmol/min/g 鲜重）＝[(ΔAGP－ΔAGPa)×V反总÷（ε×d）×109]÷(W ×V样÷V样总)÷T=643×(ΔAGP－ΔAGPa)÷W
V反总：反应体系总体积，1×10-3 L；ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.05 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g。
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文献和实验，Bradford，双缩脲法（Biuret 法），Folin 法（Lowry 法）和紫外分光光度计法。BCA 法的原理是在碱性条件下，氨基酸将二价铜还原为一价铜与 BCA 形成紫颜色的络合物，测定 562 nm 的 OD 值，所以如果样本里有还原剂（比如 DTT）的话就会对 BCA 的结果产生干扰。Bradford 法（考马斯亮蓝法）是在酸性条件下，加入考马斯亮蓝 G250 与蛋白质（主要是碱性或芳香族氨基酸）结合为蓝色化合物，吸光度值从 465nm 变成 595 nm，最后测定 595 nm 的 OD 值
10μm ，柱效以理论塔板数计大约7000～10000 。 发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。 5、检测器 （1）紫外光度检测器 它的作用原理是基于被分析试样组分对特定波长紫外光的选择性吸收，组分浓度与吸光度的关系遵守比尔定律。是最常用的检测器，应用最广，对大部分有机化合物有响应。其特点是： a 灵敏度高：其最小检测量10-9g·ml-1，故即使对紫外光吸收很弱的物质，也可以检测； b 线性范围宽；（比尔定律） c 流通池可做的很小（1mm×10mm，容积8μl）； d 对流
=A×K×4/10×n=2/5×A×K×n…………………(A3) 式中：X——样品的酶活力，u/g(u/mL); A——样品平行试验的平均吸光度; K——吸光常数; 4——反应试剂的总体积，mL; 10——反应时间10min，以1min计; n——稀释倍数。 所得结果表示至整数。 6 结果的允许差 平行试验相对误差不得超过3%。 紫外分光光度法(第二法) 1 原理
