本试剂盒仅供科研使用
谷胱甘肽 S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)试剂盒说明书
(货号:WS8020F 紫外法 48 样)
一、产品简介:
谷胱甘肽转移酶(GST; EC 2.5.1.18)是一种具有多种生理功能的蛋白质家族,清除潜
在毒性化合物,包括由氧化应激产生的物质,是细胞防御机制的一部分。
GST 催化 GSH 与 CDNB 结合,其结合产物的光吸收峰波长为 340nm;通过测定 340nm
波长处吸光度上升速率,即可计算出 GST 活性。
二、试剂盒组成和配制:
试剂名称
规格
保存要求
备注
提取液
液体 100mL×1 瓶
4℃保存
试剂一
粉体×3 瓶
-20℃保存
每瓶临用前甩几下使粉体
落入底部,外加 8.5mL 提
取液溶解,可分装保存至
-20℃,一个月内用完。
试剂二
液体 2.5mL×1 瓶
4℃保存
【注】:反应 mix 的制备(现配现用):按照试剂一:试剂二:提取液=10:1:9 的比例混匀。
三、所需仪器和用品:
紫外分光光度计、1mL 石英比色皿(光径 1cm) 、低温离心机、水浴锅、可调式移液器、
蒸馏水。
四、谷胱甘肽 S-转移酶(GST)活性检测:
建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,熟悉实验流程,避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备:
① 组织样本:
称取约 0.1g 组织(水分充足的果实样本可以取 0.2g),加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆。
12000rpm,4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
【注】:若增加样本量,可按照组织质量(
g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例进行提取
② 细菌/细胞样本:
先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取 500 万细菌或细胞加入 1mL 试剂一;
冰浴超声波破碎细菌或细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3min);12000rpm,
4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。(或按照细菌或细胞数量(104 个):试剂一体积
(mL)为 500~1000:1 的比例进行提取)
【注】:不能用细胞裂解液处理细胞。
③ 液体样本:直接检测。若浑浊,离心后取上清检测。
2、上机检测:
① 紫外分光光度计预热 30 min,温度设定 37℃,调节波长到 340 nm,蒸馏水调零。
② 可先做 2 个样本预测定,熟悉操作过程,并依据测出的吸光值 A 是否符合预判做相
应调整。
③ 在 1 mL 比色杯孔板中依次按照下表加入试剂:
试剂名称(
μL)
测定管
样本
50
反应 mix
950
混匀,37℃下,立即于 340nm 下读取 A1 值,10min 后
读取 A2 值。ΔA=A2-A1。本试剂盒仅供科研使用
2
【注】:1. 若ΔA 过小,可以延长反应时间(如:15min 或更长),或增加样本加样体系 V1(如增至 100μL,
则反应 mix 相应减少),则改变后的反应时间 T 和加样体积 V1 需代入计算公式重新计算。
2. 若 A2 大于 1.5,可以缩短反应时间(如 2min),或减少样本加样体系 V1(如减至 25μL,则
反应 mix 相应增加),则改变后的反应时间 T 和加样体积 V1 需代入计算公式重新计算。
五、结果计算:
1、按蛋白浓度计算:
活性单位定义:在上述反应条件下,每毫克蛋白每分钟催化 1nmol 的 CDNB 与 GSH 结
合为 1 个酶活单位。
GST(nmol/min/mg prot)=[ΔA÷ε÷d×V2×109]÷(Cpr×V1)÷T =208.4×ΔA÷Cpr
2、按样本质量计算:
活性单位定义:在上述反应条件下,每克样品每分钟催化 1nmol/L CDNB 与 GSH 结合为
1 个酶活单位。
GST(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA÷ε÷d×V2×109]÷(W×V1÷V)÷T=208.4×ΔA ÷W
3、按细胞数量计算:
活性单位定义:在上述反应条件下,每 104个细胞每分钟催化 1nmol/L CDNB 与 GSH 结
合为 1 个酶活单位。
GST(nmol/min/104 cell)=[ΔA÷ε÷d×V2×109]÷(细胞数量×V1÷V)÷T=208.4×ΔA÷细胞数量
4、按液体体积计算:
活性单位定义:在上述反应条件下,每毫升液体每分钟催化 1nmol/L CDNB 与 GSH 结合
为 1 个酶活单位。
GST(nmol/min/mL)=[ΔA÷ε÷d×V2×109]÷V1÷T =208.4×ΔA
ε---产物摩尔消光系数,9.6×103 L/mol /cm;
d---比色皿光径,1cm;
V---加入提取液体积,1mL;
V1---样本加样体积,50μL=0.05 mL;
V2---反应体系总体积,1000μL=1×10-3 L;
T---反应时间,10min;
W---样本质量,g;
Cpr---上清液蛋白质浓度(mg/mL),建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。