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- XY-sh0022
- 上海
- 2026年01月06日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 库存：
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- 英文名：
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- 保质期：
3个月
- 供应商：
上海烜雅生物科技有限公司
- 保存条件：
按说明书保存
- 规格：
100管/96样
微量法100管/96样
注 意 ：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
复合体Ⅰ（EC 1.6.5. 3）又称NADH-CoQ 还原酶或NADH脱氢酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，是线粒体内膜中最大的蛋白复合物。该酶催化一对电子从NADH传递给CoQ，同时可使O2还原生成O2.-，是呼吸电子传递链上产生O2.-的主要部位。测定该酶活性，不仅可以反映呼吸电子传递链（ETC）状态，而且可以反映活性氧（ROS）生成状态。
测定原理：
复合体Ⅰ能够催化NADH脱氢生成NAD+，在340nm下测定NADH的氧化速率计算出该酶活性的大小。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制：
试剂一：液体100mL×1瓶，-20℃保存；
试剂二：液体20mL×1瓶，-20℃保存；
试剂三：液体1.5mL×1瓶，-20℃保存；
试剂四：液体25mL×1瓶，-20℃保存；
试剂五：液体1mL×1支，-20℃保存；
试剂六：粉剂×1支，-20℃保存，用时加入2mL蒸馏水；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
工作液的配制：临用前将试剂五转移到试剂四中混合溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
样本的前处理：
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
- 准确称取0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL试剂一和10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
- 将匀浆600g，4℃离心5min。
- 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。
- 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅰ（此步可选做）。
- 步骤④中的沉淀即为线粒体，加入200uL试剂二和2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10秒，重复30次），用于复合体Ⅰ酶活性测定。
测定步骤：
- 分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
- 样本测定
（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本、200μL工作液和15μL试剂六，混匀，记录340nm处初始吸光值A1和 2min后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。
复合体Ⅰ活力单位的计算：
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下：
（1）按蛋白浓度计算
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅰ活力（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=1808×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
（2） 按样本鲜重计算
单位的定义：每g组织每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅰ活力（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W× V样÷V样总) ÷T=365×ΔA÷W
（3） 按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅰ活力(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T=0.73×ΔA
V反总：反应体系总体积，2.25×10-4 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.01 mL；V样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，2 min；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。
b.使用96孔板测定的计算公式如下：
（1）按蛋白浓度计算
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅰ活力（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=3616×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
（2） 按样本鲜重计算
单位的定义：每g组织每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅰ活力（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W× V样÷V样总) ÷T=730×ΔA÷W
（3） 按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅰ活力（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T=1.46×ΔA
V反总：反应体系总体积，2.25×10-4 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.01 mL；V样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，2 min；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。
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文献和实验指在生物体氧化还原中，参与电子传递的一系列氧化还原酶系，通常系指通过线粒体等的分子态氧氧化 NADH以及琥珀酸等的酶系。其电子传递顺序如下： O3 ←细胞色素（ a a3 ）复合体←细胞色素 c ←细胞色素 c1 但该顺序也表示每个前面物质的还原型将其后面物质的氧化型还原，这样反复进行，最终将分子态氧氧化成水。在呼吸链中有非血红素铁和铜原子等参与。在细胞内呼吸链系存在于线粒体的内膜上，各阶段的酶及因素可与不溶
可逆性ATP酶，能在外能驱动下逆浓差转运H 。线粒体内膜呼吸链中有三个酶复合体具有质子泵功能，能将H 由内腔转运到外腔，它们是：细胞色素c氧化酶、辅酶QH2 - 细胞色素c还原酶、NADH- 辅酶Q还原酶。细菌的的质膜上普遍有质子泵，有的伴有呼吸链组分。嗜盐菌膜上的菌紫质（bacteriorhodopsin）受光照驱动，可将H 运入菌体内浓集。
复合物I又称NADH 脱氢酶(NADH dehydrogenase)或NADH-CoQ 还原酶复合物, 功能是催化一对电子从NADH传递给CoQ，它是线粒体内膜中最大的蛋白复合物,是跨膜蛋白，也是呼吸链中了解最少的复合物。哺乳动物的复合物Ⅰ含有42种不同的亚基,总相对分子质量差不多有1000kDa。其中有7个亚基都是疏水的跨膜蛋白,由线粒体基因编码。复合物Ⅰ含有黄素蛋白(FMN)和至少6个铁硫中心(iron-sulfur centers)。一对电子从复合物Ⅰ传递时伴随着4个质子被传递到膜
