本试剂盒仅供科研使用
总黄酮(Flavonoid)试剂盒说明书
(货号:WS8110W 微板法 96 样)
一、产品简介:
总黄酮,即黄酮类化合物;是植物重要的一类次生代谢产物,具有有较强的抗氧化活性,
可捕捉活性氧自由基,降低氧化伤害,在果实中影响其色泽和风味;对植物的抗逆性和抗
病虫害方面有重要作用。
本试剂盒采用 NaNO 2 -Al(NO 3 ) 3 -NaOH 显色法测定黄酮总含量,即在碱性亚硝酸盐
溶液中,黄酮类化合物与铝离子形成在 510nm 处有特征吸收峰的红色络合物,测定反应
产物在 510nm 处的吸光值,即可计算样品中总黄酮含量。
二、试剂盒组分与配制:
试剂名称
规格
保存要求
备注
试剂一
液体 1.6mL×1 支
4℃保存
试剂二
液体 3mL×1 瓶
4℃保存
试剂三
液体 12mL×1 瓶
4℃保存
标准品
粉剂 mg×1 支
4℃保存
若重新做标曲,则用到该试剂
三、所需的仪器和用品:
酶标仪、96 孔板、粉碎仪、筛子、60%乙醇、离心机、蒸馏水。
四、总黄酮测定:
建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实
验样本和试剂浪费!
1、样本制备:
① 组织样本:
称取约 0.1g 新鲜样本(若水分充足,可增加样本取样质量);或者称取约 0.03g 烘干样
本(将样本在 105℃下杀青 3min,然后 60℃烘干至恒重,粉碎,过 40-60 目筛,得到烘
干样本),加入 1.5mL 的 60%乙醇(若鲜样需研磨均质),60℃振荡提取 2h(若蒸发用
60%乙醇定容至 1.5mL),25℃×12000rpm,离心 10min,取上清待测。
【注】:若样本量较少,可同比例缩减样本量,如取 0.02g 干样,加入 1mL60%乙醇,60℃振荡提取
2h。25℃×12000rpm,离心 10min,取上清,用 60%乙醇定容至 1mL 待测。
② 液体样本:直接检测;若浑浊,离心后取上清检测。
2、上机检测:
① 酶标仪预热 30min,调节波长至 510nm。
② 可先选取两个样本进行预测定,若 A 测定值超过 1.5,可对上清液或液体样本用 60%
乙醇进行稀释,确定适合本批样本的稀释倍数 D,相应的稀释倍数 D 需代入公式
计算。
③ 在 96 孔板中依次加入:
试剂名称(µL)
测定管
空白管(只做一次)
样本
50
蒸馏水
50
试剂一
15
15
混匀,25℃静置 6min本试剂盒仅供科研使用
2
试剂二
30
30
混匀,25℃后静置 6min
试剂三
105
105
混匀,25℃ 静置 15 min,测定 510nm 处吸光值。
ΔA=A 测定-A 空白。
【注】:1. 若待检测样本有强背景色(如粉色,红色等),需做一个样本自身对照:即试剂二用 30μL
蒸馏水替换,其他步骤同测定管,△A=A 测定-A 对照。
2. 若△A 在零附近,可通过增加样本取样质量 W,则改变后的 W 代入公式计算。
五、结果计算:
1、标准曲线方程:y = 1.6277x - 0.0049,x 是标准品浓度(mg/mL),y 是ΔA。
2、总黄酮含量(mg/g 干重)=[(ΔA+0.0049)÷1.6277×V1]÷(V1÷V×W) ×D
=0.6×(ΔA+0.0049)÷W×V×D
V---提取液体积,1.5mL;
V1---反应中样品体积,50µL=0.05ml;
W---样品质量,g。
D---稀释倍数,未稀释即为 1。
附:标准曲线制作过程:
1 制备标准品母液(
1mg/mL):称取 2mg 标准品至一新 EP 管,再加 2mL 的 60%乙醇
提取液混匀溶解,即 1mg/mL 标准品,备用。
2 把母液用 60%乙醇稀释成五个浓度梯度的标准品:0, 0.2, 0.4, 0.6,0.8,1 mg/mL。也可
根据实际样本来调整标准品浓度。
3 依据测定管的加样体系操作,根据结果即可制作标准曲线。