土拉热弗朗西斯菌探针法荧光定量PCR试剂盒

土拉热弗朗西斯菌探针法荧光定量PCR试剂盒

英文名称：Francisella tularensis Probe qPCR Kit 
土拉杆菌病，又称野兔热。土拉杆菌病是由土拉弗朗西斯菌引起的一种自然 疫源性疾病，主要感染野生啮齿动物并可传染给其他动物和人类。主要表现为体 温升高，肝、脾、肾肿大，充血和多发性粟粒坏死，淋巴结肿大，并有针尖大干 酪样坏死灶。因此灵敏快捷的诊断产品具有重要的意义。本公司开发了简单快捷 的土拉热弗朗西斯菌探针法荧光定量 PCR 检测试剂盒。

产品特点：

1. 即开即用，用户只需要提供样品 DNA 模板。 
2. 根据土拉热弗朗西斯菌保守区域设计引物和探针，能专一性地检测出样品中 的土拉热弗朗西斯菌。 
3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。 
4. 一管式闭管操作，降低了交叉污染。 
5. 本只能用于科研，足够 50 次 20μL 体系的荧光定量 PCR。

土拉热弗朗西斯菌探针法荧光定量PCR试剂盒包装规格及成分：

编号	成分	规格
试剂一	2×Probe qPCR MagicMix	500 μL（本色盖）
试剂二	荧光 PCR 专用模板稀释液	1 mL（黄盖）
试剂三	土拉热弗朗西斯菌探针法 qPCR 引物 混合液	100 μL（白盖）
试剂四	土拉热弗朗西斯菌 qPCR 探针	50 μL（棕色管）
试剂五	土拉热弗朗西斯菌探针法 qPCR 阳性 对照(1×10E8 拷贝/μL)	50 μL（黄盖）
试剂六	使用手册	1 份

运输及保存：低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。

自备试剂：DNA 模板


 

使用方法：

一、稀释标准曲线样品（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。 由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能 污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原， 本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。
1. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。
2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头， 下同）。
3. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震 荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
4. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
5. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、样品 DNA 的制备
7. 如果有 N 个样品，最好设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性 对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 阳性对照的 10000 倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为 PC。另外用水作为 NC。
8. 用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数 DNA 提取试剂盒兼 容。
三、Probe qPCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个 用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），6 个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用 水做模板），1 个用于 PCR 阳性对照（用第 4 号管的阳性对照稀释液做模 板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
10. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设 置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好 后最后加）：

成分	N+2 个 样品管	PCR 阴性 对照	PCR 阳性 对照
2×Probe qPCR MagicMix	10 μL	10 μL	各 10 μL
土拉热弗朗西斯菌 qPCR 探针	1 μL	1 μL	各1 μL
土拉热弗朗西斯菌探针法 qPCR 引物 混合液	2 μL	2 μL	各2 μL
N+2 个待测 DNA 模板	7 μL
超纯水		7 μL
第 7 步所得标准曲线样品稀释液 （2-7 号）			各7 μL（2 号样到 2 号管，3 号样到 3 号管…）

11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR：

过程	温度	时间
预变性	95℃	5 min
PCR 反应 （40 个循环）	95℃	15sec
	60℃	1 min（采集 FAM 通道的荧 光信号）

四、数据处理
12. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值 为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 RNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。
13. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大 于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该 小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小 于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。若重复结果 Ct 值小于 40，扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性，否则为阴性。



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