RNase 活性检测试剂盒（荧光标记法）

产品简介RNase活性检测试剂盒（荧光标记法）使用一种新型RNA底物，其一端标记有荧光报告基团分子(Fluor)，另一端标记有淬灭基团。在不存在RNase时，淬灭基团的物理接近会将荧光报告基团中的荧光淬灭到极低水平。当有RNase时，RNA底物被水解，荧光报告基团和淬灭基团在溶液中的空间上发生分离，这导致Fluor在被适当波长的光激发时发出明亮的荧光，该荧光可以通过多功能酶标仪（含荧光模块）和基于滤光片或单色器的荧光计进行检测。RNase活性检测试剂盒（荧光标记法）采用底物荧光标记法，可定量或定性的检测单个样品中的RNase，从而判断样本是否有RNase污染。

组分信息
储存条件1. 所有组分均干冰运输，有效期1年。
2. 收到货后，请先检查共5个组分是否齐全，然后将41309-E组分4℃保存，其它组分-20℃保存，使用时避免反复冻融。注意事项1. 本产品仅作科研用途。
2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
3. 使用本试剂前请仔细阅读本说明书，实验应规范操作，包括样本处理、反应体系的配制及加样。
4. 每个组分在使用前都应充分震荡混匀，低速离心。
5. 加样和配液步骤请严格在冰上操作，以减缓上机前酶对底物的消耗。
6. 实验需使用低吸附耗材以降低酶损耗。
7. 定量实验需使用黑色酶标板以减少本底荧光。
 使用说明1. 适用机型
包含但不限于以下仪器：Thermo Scientific: Invitrogen Qubit 4;
Molecular Devices: SpectraMax M3.
2. 实验前准备
1）在整个实验开始前，请先使用试剂盒中的Surface RNase Remover对实验环境进行处理（可稀释10倍进行喷洒或擦拭，具体可参考翌圣10609ES60使用说明书），以降低RNase污染。
2）本品可对具备活性的RNase进行检测及估值，在实验过程中可根据实际情况选择定性检测或者定量检测方法。
3. 定性检测方法
使用终点法在荧光仪或酶标仪上对待测样本进行读数，以Thermo公司Invitrogen Qubit 4荧光仪为例，开展实验。
1）配制反应体系：每次实验均需制备阴性对照、阳性对照和待测样本体系。
2）检测初始荧光值：以Qubit4为例，对阴性对照、阳性对照和待测样本进行检测，选择“Fluorometer”进入荧光检测界面后，再选择“Blue”进行检测，并记录初始荧光值“RFU₀”。
3）37℃孵育读值：将阴性对照、阳性对照和待测样本均放入37℃恒温箱孵育60 min后，重复步骤3，记录终末荧光值“RFU₆₀”。4）结果判读：若阴性对照荧光值孵育前后变化不超过50%，阳性对照RFU₆₀远大于2RFU₀，且待测样本RFU₆₀≥2RFU₀，则判定待测样本被RNase污染。
4. 定量检测方法
使用多功能酶标仪对RNase进行实时监测并定量，使用此方法可以获得RNase消化底物的实时曲线。以Molecular Devices公司SpectraMax M3多功能酶标仪为例，开展实验。
1）配制反应体系：每次实验均需配制不同浓度点RNase A标准品、无模板对照NTC、待测样本TS、待测样本对应的本底检测样本。
2）仪器设置：使用酶标仪进行本实验，选择96孔板动力学模式以及荧光检测模块，选择中等增益，设置激发光490 nm，发射光520 nm；以1 min间隔读取数据，37℃恒温连续读数1 h（视待测物污染情况而定），此方法可实时监控体系动态。
3）结果判读：
a. 若RFU₆₀≥2RFU₀，则判定待测样本被RNase污染。
b. 若判定样本已污染，则制作标准曲线检测待测样本RNase污染含量（以下示例显示总体系的污染含量，如：标准品5 pg/μL，加样量10 μL，即总体系含量50 pg）：
c. 以标准品开始读数时的前几分钟（可从时间曲线上判断线性增长期并选择合适的时间点，如下图一般选择0-3 min）所得数据制作标准曲线，再结合标准曲线和待测样本在此时间点的荧光值可得其RNase污染的估值，也可通过实时荧光曲线趋势判断待测样本中RNase的污染情况。

图1 RNase活性检测试剂盒动力曲线
 
d. 示例：已知待测样本的RFU₆₀≥2RFU₀，选择2 min时标准品各稀释梯度对应的RFU制作标准曲线（如下图），将待测样本2 min时的RFU值代入标曲公式，即得待测样本整体的RNase活性浓度。

图表2  2min时的标准曲线