肉芽肿鞘杆菌染料法荧光定量PCR试剂盒

肉芽肿鞘杆菌染料法荧光定量PCR试剂盒

英文名称：Calymmatobacterium granulomatis
荧光定量PCR( realtime fluorescence quantitative PCR，RTFQ PCR) 是1996 年由美国Applied Biosystems 公司推出的一种新定量试验技术，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。本产品就是以染料法荧光定量 PCR 技术为基础开发的专门检测肉芽肿鞘杆菌的试剂盒。

产品特点：
1. 即开即用，用户只需要提供病毒 DNA 模板。
2. 引物经过优化，灵敏性高。
3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4. 特异性高，引物是根据肉芽肿鞘杆菌高度保守的 VP1 区设计。
5. PCR mix 中含上样染料，PCR 后可以直接上样电泳。

肉芽肿鞘杆菌染料法荧光定量PCR试剂盒包装规格及成分：

编号	成分	规格
试剂一	2×PCR MagicMix	0.5 mL（棕色）
试剂二	荧光 PCR 模板稀释液	1 mL（黄盖）
试剂三	肉芽肿鞘杆菌PCR 引物混合液	100 μL（白盖）
试剂四	肉芽肿鞘杆菌PCR 阳性对照  (1×10E8 拷贝/μL)	50 μL（红盖）
试剂五	DNA 病毒裂解液试用装	15 次（9 mL）
试剂六	使用手册	1 份

运输及保存：低温运输，-20℃保存，有效期一年。

自备试剂：DNA 模板


 

使用方法：

一.稀释标准曲线样品（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA 段作为阳性对照。

1.标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。

2.用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 模板稀释液，用带芯枪头，下同）。

3.在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

4.换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

5.换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

6.重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二.样品 DNA 的制备

7.如果有 N 个样品，必须设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 上步制备的标准曲线样品的第 4 号（浓度为 1×10E4 拷贝/μL，10μL 相当于 1 万拷贝）或第 5 号（浓度为 1×10E5 拷贝/μL，10μL 相当于 10 万拷贝）再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为 PC。另外用水作为NC。如果每次制备需要 200μL 样品，则 PC 和 NC 的体积也必须是 200μL。

8.用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 DNA 提取试剂盒兼容。​

过程	温度	时间
预变性	94℃	5 min
PCR 反应 （35 个循环）	94℃	0.5 min
	50℃	0.5 min（采集 SYBR 通道的 荧光信号）
	72℃	0.5 min
后延伸	72℃	10 min

三、设置 qPCR 反应（20 μL 体系，在样品制备室进行）

9.如果只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照，6 个用于标准曲线样品。如果做 2-3次重复，则反应设置数量相应增加 2 或 3 倍。

10.在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后后加）：

成分	样品管 N+2 个	PCR 阴性 对照管	标准曲线 样品管（2-7 管）
2×qPCR MagicMix （棕色管）	10 μL	10 μL	各 10 μL
肉芽肿鞘杆菌PCR 引 物混合液（白盖）	2 μL	2 μL	各 2 μL
自备 10×ROX (见注)	2 μL	2 μL	各 2 μL
待测样品 DNA 模板	6 μL	不加	不加
第 7 步所得标准曲线样 品稀释液（2-7 号）	不加	不加	各 6μL（2 号样到 2 号管，3 号样到 3 号管…）

11.盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR（具体 PCR 参数可以根据仪器不同 而自行优化）。

四、荧光定量 PCR 反应参数

五、数据处理
12.以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。

六、电泳检测 
13.如果有必要电泳确认，可取 10-20 uL PCR 产物直接在琼脂糖凝胶上电泳产 物的大小为 400 bp。

荧光定量PCR结果分析:
一般而言，荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化;在平台期，扩增产物已不再呈指数级增加，PCR终产物量与起始模板量之间没有线性关系，无法计算起始模板拷贝数。因此只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，故选择在这个阶段进行定量分析。为了定量方便，在实时荧光定量 PCR 技术中引入了几个重要的概念：扩增曲线、荧光阈值、CT值。



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