- ￥2750
- YLKBIO
- YLK-PCR0257
- 国产
- 2025年11月05日
企业认证
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 库存：
100
- 英文名：
Enterovirus Group A(EV-A) Probe qRT-PCR Kit
- 保质期：
1年
- 供应商：
优利科（上海）生命科学有限公司
- 保存条件：
-20℃
- 规格：
50T
肠道病毒（Enterovirus）引起的传染病，临床表现轻者只有倦怠、乏力、低热等，重者可全身感染，脑、脊髓、心、肝等重要器官受损。本类疾病分布于世界各地，在热带和亚热带全年都有，在温带夏季多见，在温暖、潮湿、卫生条件差、人群拥挤的地区发病率高。肠道病毒共含有 71 个血清型。本产品以探针法荧光定量 RT-PCR 技术为基础开发的专门检测肠道病毒 A 组的试剂盒，它具有下列特点：
- 即开即用，用户只需要提供样品 RNA 模板。
- 引物和探针经过优化，灵敏性高。
- 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
- 特异性高，引物是根据肠道病毒 A 组高度保守区设计，不会跟其他病毒的
- 本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 RT-PCR 反应。
规格及成分
| 成 份 | 十孔盒包装 |
| 2×qRT-PCR 缓冲液 | 500 μL（棕色管） |
| 10×qRT-PCR 酶混合液 | 100 μL（红盖） |
| ROX 染料I | 50 μL（棕色管） |
| ROX 染料 II | 50 μL（棕色管） |
| 荧光 PCR 专用模板稀释液 | 1mL（亮黄盖） |
| 肠道病毒 A 组 RT-PCR 引物混合液 | 100 μL（白盖） |
| 肠道病毒 A 组 RT-PCR 阳性对照 （1×10E8 拷贝/μL） |
50 μL（黄盖） |
| 核酸释放剂试用装 | 20 次（1mL，绿盖） |
| 使用手册 | 1 份 |
运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。阳性对照需要因易污染其他成分需
要单独放置。本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供 RNA 片段作为阳性对照。
自备试剂
样品 RNA
使用方法
一、稀释阳性对照（以 10E2-10E7 这 6 个 10 倍稀释度为例。由于标准品浓度非
常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原。
1. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。用带芯枪头分别加入 45 μL 荧
光 PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。
- 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(本试剂盒提供)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
- 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
- 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。
二、样品 RNA 的制备
- 如果有 N 个样品，必须设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 上步制备的阳性对照梯度稀释液中的第 4 号（浓度为 1×10E4 拷贝/μL，10μL 相当于 1 万拷贝）再加上一定量的水作为制备的阳性对照（加水后其总体积跟样品一样，样品体积多少取决于所用试剂盒的要求）。可以用水作为制备的阴性对照。
- 用自选方法纯化 N+2 个样品的 RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 RNA 提取试剂盒兼容。本试剂盒免费赠送 20 次免 RNA 提取的核酸释放剂试用装。其使用手册可以向本公司客服索取。设置 RT-PCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）
- 如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照，6 个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），1 个用于 PCR 阳性对照（用第 4 号阳性对照稀释液做模板）。下面只描述定量分析的步骤，定性分析只是把 6 个标曲反应缩减成 1 个，其余不变。
- 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设
- 置完毕后才设置阳性对照，阳性对照样品要等所有管子盖上盖子后最后加）
成分 N+2 个制备
所得样品RT-PCR
阴性对照RT-PCR 阳性
对照（2-7 管）2×qRT-PCR 缓冲液 10μL 10μL 各 10μL 肠道病毒 A 组
RT-PCR
引物混合物
2μL
2μL
各 2μL50×ROX (见注) 0.4μL 0.4μL 各 0.4μL 样品制备所得 RNA 模
板（来于第 8 步）5.6μL 不加 不加 稀释所得 6 个阳性对照
（来于第 6 步）
不加
不加各 5.6μL（2 号样到 2 号管，3 号样
到 3 号管…）10×qRT-PCR
酶混合液2μL 2μL 2μL
需使用 ROX 染料 II 的机型：：ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research
的 Chromo4、Opticon（II）Corbett Rotor Gene 3000。
不需要使用 ROX 的机型：Thermal Cycle Dice Real Time System， LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene 3000、RotorGene 6000。
- 上机后按下面参数进行 RT-PCR（参数可能会因仪器不同而需优化）。
过程 温度 时间 RT（逆转录） 50℃ 15-30 分钟 预变性 94℃ 2 分钟
RT - PCR 反应
（30 个循环）95℃ 15 秒 60℃ 15 秒（采集 FAM 通道的荧光信号） 72℃ 15 秒 按仪器预设程序进行溶解曲线分析
- 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 RNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。
- 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大
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文献和实验性，因而即使是最具挑战性的模板也可以进行有效的RT-PCR.。 通过SuperMix形式快速合成cDNA SuperScript™ III First—Strand Synthesis SuperMix将所有进行强大的、灵敏的第一链cDNA合成所必须的组分组合成快速、易于使用的 SuperMix形式。SuperMix形式包含 2x RT缓冲反应混合物、dNTPs、MgCl2、 以及由SuperScript™ III RT和RNaseOUT™.组成的酶混合物。也提供优化的退火缓冲
码RNA？mRNA还有不翻译的RNA呢。应该说转录水平指的是RNA水平，而蛋白应该叫翻译水平？我们这里就特指编码蛋白的mRNA的量的检测吧！方法：很多很多，我们常用的也就是RT-PCR和northern（实际上我也只知道他们，丢人啊），但是RNA没保护分析在国外很常用，也有半定量的功能，一次性试剂盒还能以此将一个表达簇一起分析，例如NFkB的转录激活谱中的8个常见基因。至于dot blot和原位杂交之流则实属于吃力不讨好，不知所云，骗人玩玩的啦，dot blot的最大贡献是发展到了反向dot blot
含有适当的DNA聚合酶的两步法RT-PCR系统或具有高保真Platinum Taq酶的一步法RT-PCR系统 高保真度 含有Pfx Taq酶的两步法RT-PCR系统 长的反转录结果 通常使用两步法RT-PCR系统可达到最佳结果含Elongase酶的一步法RT-PCR系统 回到页首 二、Generacer 1. 如何针对Generacer试剂盒设计基因特异性引物（GSP）？ 使用5’或3’RACE试剂都需要至少一条基因特异性引物，您在设计引物时需要注意以下几点要求：*50-70％
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