12,000 ´ g 4 oC 离心10分钟。取上清液转移到新管。注意:组织纤维碎片、植物多糖和多酚等沉淀在管底。大部分基因组DNA也在管底形成疏松粘稠的团状物。取上清液时如吸入少量拉丝状DNA粘稠物,不影响后续实验。
加入0.5 ml Extraction Reagent,充分颠倒混匀,冰上孵育10分钟。
离心12,000 ´ g 4 oC 10分钟,溶液分为两相。RNA在上层水相,下层为有机相,两相界面是一层薄膜,其厚度与组织细胞类型和多少有关。小心吸出水相转移到新离心管。注意:取上清液时应保留0.5-1 mm厚的水相,以免扰动和吸入下面的碎片和有机相。如果吸入,应将所取的上清液放回管中并重新离心10分钟,再次吸取水相。这一点至关重要,违背此原则容易导致RNA降解和DNA污染。
优化步骤:对多糖含量特别丰富的植物,加入上清液1/10体积(50~70ml)的Plant RNA Aid (如有沉淀,用前轻摇重悬)到上清液,混匀,冰上孵育20分钟以进一步结合植物多糖和多酚,溶液将会变浑浊。离心12,000 ´ g 4 oC 10分钟。小心吸出上层水相转移到新离心管,勿扰动和吸入下面的透明胶冻状沉淀。注意:完全去除植物多糖至关重要,否则将明显降低RNA回收率,并使沉淀呈难溶解的胶冻状。