组织细胞总 SOD 活性检测试剂盒(WST-8 法) (Total SOD Assay Kit-WST-8)
E2011
描述:超氧化物岐化酶(Superoxide Dismutase, SOD) 能催化超氧化物阴离子发生岐化作用,生成过氧化氢和
氧气,是生物体内一种重要的抗氧化酶。在生物抗氧化机制中扮演重要角色。目前测定 SOD 活性常用方法
有 WST-1 法和 WST-8 法,其中 WST-8 法比 WST-1 法更加稳定、灵敏度更高。本试剂盒采用了目前测定
SOD 方法中稳定性更好、灵敏度更高的的 WST-8 法。
原理:
WST-8 可以和黄嘌呤氧化酶催化产生的超氧化物阴离子反应产生水溶性的甲臜染料(formazan dye),该反应
步骤可以被 SOD 所抑制。通过对 WST-8 产物的比色分析即可计算 SOD 酶活力。
适用范围:实体组织、细胞中等总 SOD 活性。
组成:(100 次)
1. SOD 检测缓冲液: 70 ml
2. WST-8: 800 ul
3. 酶溶液: 100ul
4. 反应启动液(40X): 60ul
5. 组织细胞裂解液 100ml
储存:-20℃避光保存,6 个月有效。
操作步骤:
1. 样品的准备:
a. 细胞样品的准备:收集细胞,用 4 ℃或冰浴预冷的 PBS 或生理盐水洗涤 1-2 遍。沉淀用预冷组织细胞裂
解液 4 ℃或冰浴匀浆( 可以使用玻璃匀浆器或各类常见电动匀浆器) 。随后匀浆液 4℃离心,取上清作为待
测样品。
b. 组织样品的准备:动物用生理盐水(0.9% NaCl ,含有 0.16mg/ml 肝素钠) 灌流清除血液后获取组织样品。
按照每 100mg 加入 500-1000ul 组织细胞裂解液比例,
4 ℃或冰浴匀浆( 可以使用玻璃匀浆器或各类常见电
动匀浆器) 。随后匀浆液 4 ℃离心,取上清作为待测样品。
d. 使用 BCA 蛋白浓度测定试剂盒(P1511)测定蛋白浓度。通常 10-20ug 蛋白的细胞或组织匀浆液样品中
SOD 平均活力约 1 个活力单位左右(不同细胞和组织的差异会比较大,该活力范围仅作为初步的参考) 。每北京普利莱基因技术有限公司 电话:010-62027915 62053186 Email: service_applygen@163.com
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种样品准备 20-100 ug 蛋白量通常已经足够用于后续检测。
e. 根据蛋白浓度和预计的蛋白使用量,用试剂盒提供的 SOD 检测缓冲液适当稀释样品。例如,小鼠肝脏通
常需要稀释 10-100 倍。准备好的样品如果当天测定,可以冰浴保存;如果当天不能完成测定,可以-70 ℃
冻存,但建议尽量当天完成测定。
2. 试剂盒的准备工作:
a. WST-8 酶工作液的配制: 参照下表,根据待检测样品(包括标准品) 数量,配制适量 WST-8 酶工作液,
配制好的 WST-8 酶工作液 4 ℃或冰浴保存,可当天使用,但建议尽量现配现用。
注意:由于酶溶液的用量较少且易沉降,必须注意在使用前先轻轻离心一下,然后适当混匀后再使用。
待测样品数量
1
10
20
50
SOD 检测缓冲液(μl)
151
1510
3020
7550
WST-8( μ l)
8
80
160
400
酶溶液(μl)
1
10
20
50
WST-8/酶工作液(μl)
160
1600
3200
8000
b. 反应启动工作液配制:将试剂盒提供的反应启动液 (40X) 溶解后混匀,按
1μl 反应启动液(40X) 加入
39μl SOD 检测缓冲液的比例进行稀释,即为反应启动工作液。4℃或冰浴保存,可当天使用,但建议尽量
现配现用。
c. (可选做) SOD 标准品准备:需自备 SOD 标准品,用本试剂盒提供的稀释液将 SOD 标准品稀释至如下系
列浓度:20U/ml,10U/ml ,5U/ml,2.5U/ml,1.25U/ml,0.625U/ml。在随后的检测中可以各取 20 微升,
参考样品进行检测。说明:为避免稀释后 SOD 酶活性的下降, SOD 标准品宜现稀释现使用;本试剂盒对
于 SOD 的检测并不需要 SOD 作为标准品,但可以使用 SOD 标准品作为阳性对照或作为对 SOD 活性定量
的参考。
3. 样品测定:
a. 参考下表使用 96 孔板加入各个组分,注意设置样品孔和各种空白对照孔。
注意:加入反应启动工作液后反应即会开始,可以在低温操作或用排枪操作以减小各孔间因加入反应启动
工作液的时间先后差异而导致的误差。
样品
空白对照 1
空白对照 2
空白对照 3*
待测样品
20μl
---
---
20μl
SOD 检测缓冲液
---
20μl
40μl
20μl
WST-8/酶工作液
160μl
160μl
160μl
160μl
反应启动工作液
20μl
20μl
---
---
* 如果样品有颜色或含有抗氧化物质,则需设置空白对照 3;如果样品没有颜色并且也不含有抗氧化物则没
有必要设置空白对照 3。
b. 37℃孵育 30 分钟。
说明:孵育 25 至 35 分钟检测出来的 SOD 活力无显著差异,但为保证检测结果的一致性,推荐孵育 30 分
钟。
c. 450nm 测定吸光度。如无 450nm 滤光片,可以使用 420-480nm 的滤光片。也可以使用大于 600nm 的波北京普利莱基因技术有限公司 电话:010-62027915 62053186 Email: service_applygen@163.com
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长作为参考波长进行双波长测定。
4. 样品中总 SOD 活力的计算:
a. 抑制百分率的计算:
参考如下计算公式计算抑制百分率:
抑制百分率=[(A 空白对照 1-A 空白对照 2)-(A 样品-A 空白对照 3)] / (A 空白对照 1-A 空白对照 2) ×
100%
如果没有设置空白对照 3,则可以把计算公式简化为:
抑制百分率=(A 空白对照 1-A 样品) / (A 空白对照 1-A 空白对照 2) × 100%
如果计算出来的抑制百分率小于 30% 或大于 70% ,则通常需要把该样品重新测定。尽量使样品的抑制百
分率在 30-70%范围内。如果测定出来的抑制百分率偏高,则需适当稀释样品;如果测定出来的抑制百分率
偏低,则需重新准备浓度较高的待测样品。
b. SOD 酶活力单位的定义:在上述黄嘌呤氧化酶藕联反应体系中抑制百分率为 50% 时,反应体系中的 SOD
酶活力定义为一个酶活力单位 (unit)。注意:SOD 的活力单位的定义方式有很多种,不同的活力单位需根
据其定义的不同进行适当换算。
c. SOD 酶活力的计算:
SOD 酶活力的计算公式如下:
待测样品中 SOD 酶活力单位=检测体系中 SOD 酶活力单位=抑制百分率/ (1-抑制百分率) units
例如,当抑制百分率为 50% 时,待测样品中 SOD 酶活力单位=50% / (1-50%)units=1 unit;当抑制百分
率为 60% 时,待测样品中 SOD 酶活力单位=60% / (1-60%)units=1.5 units。
d.可以根据样品的蛋白浓度和稀释倍数,将 SOD 活力单位换算为 U/g 或 U/mg 蛋白。
说明:
1. 待测样品-70 ℃可保存 1 个月。需注意反复冻融会导致 SOD 部分失活。
2. 细胞或组织等样品制备时不能采用含有 Triton X-100 等去垢剂的溶液,否则会干扰本试剂盒的检测。
3. 抗氧化物会对本试剂盒的检测产生干扰,例如 0.1mM ascorbic acid,5mM GSH 都会使测定出来的吸光度
显著升高。此时,尽管样品没有颜色,如果设置了使用说明中的空白对照 3,就可以消除样品中的抗氧化物
的干扰。
4. 反应启动工作液加入后会立即有超氧化物生成,请用多通道移液器来加酶工作液以缩短时间,减少各孔
间误差。
5. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。