外泌体电镜,NTA,机制研究

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什么是外泌体外泌体是指包含了复杂 RNA 和蛋白质的小膜泡 (30-150nm)，现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。广泛存在于细胞培养上清及各种体液中，包括血液、淋巴液、唾液、尿液、卵泡液、精液、心包液、乳汁等。1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现， 1987年Johnstone将其命名为“exosome”。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中 。获得外泌体后，对外泌体进行标记，观察外泌体被摄取情况，再进一步探索外泌体的功能，如组织修复、肿瘤转移、代谢重建等等。
 

1.外泌体分离提取

外泌体分布在生物体液以及细胞培养上清中，分离提取的方法有很多，例如，超速离心法，磁珠免疫法，PEG沉淀法，排阻色谱法SEC等，每种方法都有各自的优缺点。比较常见的就是超速离心法，还有使用商业化的外泌体提取试剂盒等等。

2.外泌体鉴定

（1）电镜：分析外泌体的大小/形态，一般多用透射电镜；

样本一般就是外泌体溶液，通过超速离心获得的样本，取25%的电镜固定液11uL，加入100uL外泌体中混匀，4度固定过夜。 将样本滴在碳支持膜铜网放置3-5min，然后用滤纸吸去多余液体。透射电子显微镜下观察，采集图像分析。

 

（2）WB：检测外泌体标志蛋白的表达；

蛋白质印迹法（免疫印迹试验）即Western Blot,是将电泳分离后的细胞或组织中蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。应用非常广泛。

（3）纳米颗粒示踪分析NTA：检测外泌体粒径及浓度；


 

3.外泌体转录组学和蛋白组学分析

外泌体中携带有来自母本细胞的多种蛋白质、脂类、RNA等重要信息。外泌体RNA，包括非编码RNA（microRNA、lncRNA、circRNA）与编码RNA（mRNA），它们在细胞间起着信息传递、调控基因表达的重要作用。

转录组学分析：对外泌体中的RNA 进行转录组测序及分析；

作用：能够筛选外泌体携带的特异 Biomarker，对深入了解疾病或不同发育阶段的内在机制有重要意义。

蛋白组学分析：是指利用质谱技术对外泌体蛋白进行分析(外泌体膜上的蛋白质/外泌体中包含的蛋白质)，外泌体蛋白质组学成为发现癌症标志物的一个新研究方向。

作用：研究外泌体及蛋白质在生命活动如疾病发生和进展中的作用；发现与疾病相关的蛋白质，作为疾病早期诊断和预后评估的生物标志物。

 

4.外泌体功能验证（外泌体示踪）

目前已发表的外泌体文章中，外泌体大多使用亲脂性染料进行标记，体内和体外都有较多应用。

（1）体外验证功能：筛选外泌体关键分子及作用机制通路。包括受体细胞对外泌体的摄取，摄取后受体细胞的基因表达验证及功能检测，如细胞增殖、凋亡、迁移等。亲脂性染料主要分为两大类，第一类是PKH67（绿色荧光）/PKH26（红色荧光），由于它们可以与外泌体的脂质双层膜稳定结合，所以染色效果较好，应用较广泛。


PKH67标记的外泌体与心肌细胞共培养

外泌体内吞实验。图中绿色的部分是鬼笔环肽染色，鬼笔环肽是应用于细胞骨架的染色。因为，可以明显的看到外泌体处于细胞的内部，被心肌细胞吞噬。



PKH67标记的外泌体与神经元之间相互作用Acta Neuropathol Commun. 2018 Feb 15;6(1):10.
 

（2）体内实验：证明疾病动物模型外泌体功能。包括动物模型构建、外泌体注射动物模型、活体成像、动物表型检测等。

体内验证小动物活体成像方法：

荧光成像：荧光标记外泌体，如Cy5，DiR等，注射动物模型，检测外泌体在动物模型体内各器官分布情况；

1.Di系列的亲脂性染料，包括DiI（橙色荧光）、DiO（绿色荧光）、DiD（红色荧光）、DiR（深红色荧光）。其中DiR的红外荧光可穿透细胞和组织，在活体成像中用来示踪。