RIP（RNA 结合蛋白免疫沉淀）

用抗体或表位标记物捕获细胞核内或细胞质中内源性的RNA结合蛋白。防止非特异性的RNA的结合。免疫沉淀把RNA结合蛋白及其结合的RNA一起分离出来。结合的RNA序列通过microarray（RIP-Chip），定量RT-PCR或高通量测序（RIP-Seq）方法来鉴定。

RIP 技术（RNA Binding Protein Immunoprecipitation Assay，RNA 结合蛋白免疫沉淀）主要是运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA 进行q-PCR验证或者测序分析。RIP 是研究细胞内RNA 与蛋白结合情况的技术，是了解转录后调控网络动态过程的有力工具。RIP可以看成是普遍使用的染色质免疫沉淀ChIP技术的类似应用，但由于研究对象是RNA-蛋白复合物而不是DNA-蛋白复合物，RIP实验的优化条件与ChIP实验不太相同，如：RIP反应体系中的试剂和抗体绝对不能含有RNA酶，抗体需经RIP实验验证等等。

RIP实验步骤

 

一、获取细胞裂解液

• 冷PBS清洗培养皿或培养瓶中的细胞两次
• 加入冷PBS后用细胞刮将细胞刮下来，收集至eppendoff管
• 1500rpm，4℃离心5min，弃上清，收集细胞
• 用与细胞等体积的RIP裂解液重悬细胞，吹打均匀后于冰上静置5min
• 每管分装200μl细胞裂解液，贮存于-80℃

二、制备磁珠-抗体

• 重悬磁珠
• 标记实验所需的eppendoff管
• 吸取50μl 重悬后的磁珠悬液于每个eppendoff管
• 每管加入500μl RIP Wash Buffer，涡旋震荡
• 将eppendoff管置于磁力架上，去上清，重复一次
• 用100μl的RIP Wash Buffer重悬磁珠
• 室温孵育30min
• 将eppendoff管置于磁力架上，弃上清
• 加入500μl RIP Wash Buffer，涡旋震荡后弃上清，重复一次
• 加入500μl RIP Wash Buffer，涡旋震荡后置于冰上

三、RNA结合蛋白免疫沉淀

• 准备RIP Immunoprecipitation Buffer
• 将前上步的eppendoff管放磁力架上，去上清，每管加入900ul RIP Immunoprecipitation Buffer
• 迅速解冻第一步制备的细胞裂解液，离心。吸取100μl上清液于上一步的磁珠-抗体复合物中，使得总体积为1ml
• 4℃孵育3h至过夜
• 短暂离心，将eppendoff管放在磁力架上，弃上清
• 加入500μl RIP Wash Buffer，涡旋震荡后将eppendoff管放在磁力架上，弃上清，重复清洗6次

四、RNA纯化

• 准备Proteinase K Buffer。每个样品需150ul
• 用150ul Proteinase K Buffer重悬上述磁珠-抗体复合物
• 55℃孵育30min
• 孵育完之后，将enpendoff管置于磁力架上，将上清液吸入一新的enpendoff管中
• 于每管上清液中加入250μl RIP Wash Buffer
• 于每管加入400μl苯酚：氯仿：异戊纯，涡旋震荡，室温下14,000rpm离心10min
• 小心吸取350μl上层水相，吸入另一新的enpendoff管
• 于每管加入400μl氯仿，涡旋震荡15s，室温下14,000rpm离心10min
• 小心的吸取300μl上层水相，吸入另一新的enpendoff管
• 每管加入50μl Salt SolutionⅠ，15μl Salt SolutionⅡ,5μl Precipitate Enhancer ，850μl 无水乙醇（无RNase），混合，-80℃保持1h至过夜
• 14,000rpm，4℃离心30min，小心去上清
• 用80%乙醇冲洗一次，14,000rpm，4℃离心15min，小心去上清，空气中晾干.
• 10-20μl DEPC水溶解，-80℃保存