贴壁细胞转染方法步骤(以24孔板转染质粒DNA为例): A、细胞接种: 1、 转染前一天将细胞铺板(使用不含抗生素的完全培养基),每孔2.0×105个细胞左右,使转染时细胞密度为90%; 2、最好在转染开始之前更换新鲜的含血清培养基,以防转染后孵育阶段细胞密度太大、营养不足导致细胞死亡。 B、Lipofect5000/DNA复合物包装(该步完成后应立即进行转染): 1、使用前混匀转染试剂,在1.5 ml无菌离心管A中加入50µl无血清 培养基,并添加适量的转染试剂(参见附表)。用移液器轻轻混匀后在室温静置5-10分钟。 2、在1.5ml无菌离心管B中加入50µl无血清培养基,并添加适量的DNA,用移液器轻轻混匀后在室温静置5~10分钟。 3、将DNA-培养基混合物滴加至Lipofect5000-培养基混合物中,用移液器轻轻混匀后在室温静置15~20分钟后,立即转染。 注意:离心管最好使用聚丙烯离心管。 C、转染: 1、将步骤B制备的复合物滴加至细胞培养孔中。轻轻晃动培养板以使复合物均匀分布。 2、转染4小时后,向培养孔中加入适量的溶液A,轻轻晃动培养板,使溶液A与培养基混匀,具体见下表。 3、 培养24小时后即可观察,但最佳观察时间为36-48小时。如果需要,细胞培养6~24小时后可以更换新鲜完全培养基,但不是必须。 4、 收获细胞,进行后续实验。对于稳定转染,在转染24~48小时后,用选择培养基传代培养。 |