红霉素-N-脱甲基酶(ERND)科研专用测试盒/可见分光光度

注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
细胞色素P450酶是一组主要存在于肝脏的酶系，在外源物质代谢中，尤其是药物和毒物的代谢，具有重要作用。ERND在P450酶系中相当于CYP2B亚型，与药物代谢的去甲基化密切相关。CYP2B具有催化底物形成非活性易于排泄的代谢产物而具有解毒作用，也可使某些药物经CYP2B代谢活化。

测定原理：
ERND催化红霉素释放甲醛，通过Nash比色测定甲醛含量，即可计算出ERND活性。

自备仪器和用品：
可见分光光度计、普通离心机，超速离心机、可调式移液枪、1mL玻璃比色皿、蒸馏水和冰。

试剂组成和配制：
试剂一：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加50 mL蒸馏水溶解。
试剂二：液体×1瓶，4℃保存。
试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加2.6 mL蒸馏水，充分溶解。
试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加2.6 mL蒸馏水，充分溶解。
试剂五：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前，加蒸馏水9 mL充分溶解。
试剂六：液体×1瓶，4℃保存。
试剂七：液体×1瓶，4℃保存。
标准液：液体×1瓶，-20℃保存。临用前取1.5 mL EP 管，加入10μl标准液，加990μl蒸馏水.

粗酶液提取：
1、除去细胞核，线粒体等大分子物质：称约0.5g组织，加入1mL试剂一，冰上充分研磨，10 000g 4℃离心30min，取上清液，转入超速离心管中。
2、粗制微粒体：100 000g，4℃，离心60min，弃上清液。
3、除血红蛋白等杂质：向步骤2的沉淀中加1mL试剂一，盖紧后充分震荡溶解，100 000g离心30min，弃上清液。
4、终微粒体：向步骤3的沉淀中加试剂二0.5mL，充分震荡溶解，即粗酶液，待测。该待测液需当天使用。



测定操作：
1. 分光光度计预热30 min以上，调节波长到412 nm，蒸馏水调零。
2. 试剂二置于37℃水浴中预热30 min。
3. 对照管：取1支EP管，加入50μL粗酶液，850μL试剂二，50μL试剂三，50μL蒸馏水，混匀后置于37℃水浴保温30min；立即加入175μL试剂五，混匀后置于冰浴中5min；取出后加入175μL试剂六，混匀后室温静置5min；室温8000rpm离心5min；取新的EP管，加入500μL上清液，500μL试剂七，混匀后60℃水浴10min，然后取出，用冷水冷却5min，于412nm测定光吸收，记为A对照管。
4. 测定管：取1支EP管，加入50μL粗酶液，850μL试剂二，50μL试剂三，50μL试剂四，混匀后置于37℃水浴保温30min；立即加入175μL试剂五，混匀后置于冰浴中5min；取出后加入175μL试剂六，混匀后室温静置5min；室温8000rpm离心5min；取1支新EP管，加入500μL上清液，500μL试剂七，混匀后60℃水浴10min，然后取出，用冷水冷却5min，于412nm测定光吸收，记为A测定管。
5. 标准管：取1支EP管，加入500μL标准品，500μL试剂七，混匀后60℃水浴10min，然后取出，用冷水冷却5min，于412nm测定光吸收，记为A标准管。
注意：每个样品都需要做对照管。