柠檬酸合酶(CS)科研专用测试盒/可见分光光度法

注　意：正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
CS（EC 2.3.3.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体基质中，是三羧酸循环个限速酶，是三羧酸循环主要调控位点之一。

测定原理：
CS 催化乙酰 CoA 和草酰乙酸产生柠檬酰辅酶 A，进一步水解产生柠檬酸；该反应促使无色的 DTNB 转变成的 TNB，在 412nm 处有特征吸光值。

需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰、无水乙醇和蒸馏水

试剂组成和配制：
试剂一：液体 50mL×1 瓶，-20℃保存；
试剂二：液体 10mL×1 瓶，-20℃保存；
试剂三：液体 1mL×1 支，-20℃保存；
试剂四：液体 55mL×1 瓶，4℃保存；
试剂五：粉剂×1 瓶，4℃保存；
试剂六：粉剂×1 支，-20℃保存，临用前加入 2.4mL 蒸馏水，用不完的试剂仍-20℃保存；

样本的前处理：
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
①称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
②将匀浆 600g，4℃离心 5min。
③弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。
④上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的 CS（此步可选做）。
⑤在步骤④的沉淀中加入 200uL 试剂二和 2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率 20％或200W，超声 3 秒，间隔 10 秒，重复 30 次），用于线粒体 CS 测定。



测定步骤：
1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 412nm，蒸馏水调零。
2、样本测定
（1）在试剂五中加入 1.2mL 无水乙醇和 26mL 试剂四，混匀，37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）孵育 5min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
（2）测定管：在 EP 管中加入 40μL 样本、880μL 试剂五和 40μL 试剂六，混匀，37℃反应 15min 后立即测定吸光值 A1。
（3）对照管：在 EP 管中加入 40μL 样本、880μL 试剂四和 40μL 试剂六，混匀，37℃反应 15min 后立即测定吸光值 A2。
（4）计算 ΔA=A1-A2，每个测定管设一个对照管。