辅酶ⅠNAD(H)含量测试盒_微量法

辅酶ⅠNAD(H)含量测试盒_微量法
测定方法：微量法
产品规格：100管/48样
储存条件：低温保存
注   意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
辅酶ⅠNAD(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，NAD+是糖酵解（EMP）和三羧酸循环（TCA）的主要氢受体，生成的NADH经呼吸电子链（ETC）传递把电子交给氧，在合成ATP的同时，形成大量的ROS，同时NADH再生为NAD+。糖、脂、蛋白质三大代谢物质分解中的氧化反应绝大部分通过这一体系完成。NAD(H)含量和NADH/NAD+比值的高低可用于评价糖酵解和TCA循环的强弱。较高的NAD(H)及NADH/NAD+比值说明细胞呼吸耗氧量较高，处于过氧化状态。此外，NADH/NAD+比值升高也可抑制糖酵解和TCA循环。另外，NAD+降解产物对细胞信号传导、代谢和基因表达等具有重要的调控作用。

测定原理：
分别用酸性和碱性提取液提取样品中NAD+和NADH，NADH通过PMS的递氢作用，还原氧化型噻唑蓝（MTT）为甲瓒，在570nm下检测吸光值；而NAD+可被乙醇脱氢酶还原为NADH，进一步采用MTT还原法检测。

需自备的仪器和用品：
酶标仪、台式离心机、移液器、96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：
酸性提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存；
碱性提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存；
试剂一：液体10 mL×1瓶，4℃保存； 
试剂二：液体3 mL×1瓶，4℃保存；
试剂三：粉剂×1瓶，-20 ℃保存，用时加入3mL蒸馏水，混匀，用不完的试剂4℃保存一周；
试剂四：粉剂×1瓶，4 ℃保存，用时加入3mL蒸馏水，混匀，用不完的试剂4℃保存一周；
试剂五：液体3.6mL×1瓶，4 ℃保存；
试剂六：液体30mL×1瓶，4 ℃保存；
试剂七：液体50mL×1瓶，4 ℃保存。




测定步骤：
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至570nm，蒸馏水调零。
2、加样表(在1.5mL棕色EP管中按下表依次加样）：

试剂名称(μL)	对照管	测定管
样本	20	20
试剂一	80	80
试剂二	30	30
试剂三	30	30
试剂四	30	30
试剂五	30	30
试剂六	200	混匀，室温避光静置20min
试剂六		200

充分混匀，静置5min后，20000g，25℃离心5min，弃上清，沉淀中加入：

试剂七

400

400

混匀，取200μL转移至微量石英比色皿或96孔板中，570nm下读取对照吸光值A1和测定管吸光值A2，计算△A=A2-A1。

注意事项：
1、如果一次性测定样本数较多，可将试剂一、二、三和四按比例配成混合液。
2、对照管和测定管的测定步骤的区别：对照管加完试剂一、二、三、四和五后必须马上加试剂六；测定管
加完试剂一、二、三、四和五后必须反应20min后再加试剂六。
3、反应过程中注意避光。
4、若NAD+测定中△A（A2-A1）≤0.0302，NADH测定中△A（A2-A1）≤0.0222，说明样本中辅酶含量较低，已低于检测限，可做如下调整：（1）将测定管避光静置时间20min延长到60min；（2）在提取阶段增加取样量，即取0.2g样本或0.2mL样本加入1mL提取液。
5、由于每一个测定管需要设一个对照管，本试剂盒100管保证测48个NAD+或NADH.