Ca++Mg++ ——ATP酶测试盒_可见分光光度法

Ca++Mg++ ——ATP酶测试盒_可见分光光度法
测定方法：可见分光光度法
产品规格：50管/24样    
储存条件：低温保存
注   意 ：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
Ca⁺⁺ Mg⁺⁺-ATP酶广泛分布于植物、动物、微生物和细胞中，可催化ATP水解生成ADP和无机磷。

测定原理：
根据Ca⁺⁺ Mg⁺⁺-ATP酶分解ATP生成ADP及无机磷，通过测定无机磷的量来确定ATP酶活性高低。

需自备的仪器及用品:
可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：
提取液： 液体50mL ×1 瓶，4℃保存。
试剂一：液体 10mL×1 瓶，4℃保存。
试剂二：液体 5mL×1 瓶，4℃保存。
试剂三：液体 5ml×1 瓶，4℃保存。
试剂四：粉剂×3 支，-20℃保存。用时每支加1mL蒸馏水，现用现配；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
试剂五：液体 5mL×1 瓶，4℃保存。
试剂六：粉剂×1瓶，4℃保存。用时加入3mL蒸馏水， 4℃保存。
试剂七：粉剂×1瓶, 4℃保存。用时加入25mL蒸馏水，溶解后4℃保存一周。
试剂八：粉剂×1瓶, 4℃保存。用时加入25mL蒸馏水，溶解后4℃保存一周。
试剂九：液体25mL×1 瓶，室温保存。
试剂十：10mmol/L 标准磷贮备液 10mL×1 瓶，4℃保存。
0.5μmol/mL 标准磷应用液配制：将试剂十 20倍稀释，即取 0.1mL试剂十加1.9mL蒸馏水充分混匀。
定磷剂的配制：按H₂O: 试剂七:试剂八:试剂九=2:1:1:1 的比例配制，配的定磷剂应为浅。若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，定磷剂现用现配。
注意：配试剂用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。





操作步骤：
1、分光光度计预热30min以上，调节波长至660nm，蒸馏水调零。
2、酶促反应（在EP管中加入下列试剂）

	对照管	测定管
试剂一（μL）	130	90
试剂二（μL）	40	40
试剂三（μL）	40	40
试剂四（μL）	40	40
试剂五（μL）		40
样本  （μL）		200

混匀，37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）准确水浴10min

试剂六（μL）	50	50
样本 （μL）	200

混匀，8000g，25℃离心10min，取上清液
3定磷（1.5mLEP管中依次加入下列试剂）

	空白管	标准管	对照管	测定管
0.5μmol/ml标准磷应用液（μL）		100
上清液（μL）			100	100
蒸馏水（μL）	100
定磷试剂（μL）	1000	1000	1000	1000

混匀，室温放置30 min，在 660nm处比色。
注意事项：
1、由于每一个样都必须做对照，本试剂盒50管只能测 24份Ca⁺⁺ Mg⁺⁺-ATP酶。
2、此法具有微量、灵敏、快速的特点。所以对测定所用试管要求严格无磷。避免磷污染是检测成败的关键。
3、空白管和标准管只要做一管。