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上海惠研生物科技有限公司
全基因组甲基化分析
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DNA甲基化对生长发育调控,以及很多病理机制(包括在癌症中)发挥着重要的调控作用。本方案可以分析DNA甲基化的分布规律,DNA甲基化在分化过程中的改变模式,以及DNA甲基化与染色质组蛋白修饰模式之间的关联。例如,通过考察哺乳动物生殖干细胞及其分化细胞之间DNA甲基化模式的改变,可以发现包含绝大多数CpG岛,转座子,保守非编码RNA和其他基因组区域上的DNA甲基化情况,并进行归类统计。
(1) 细胞分化过程中的CpG甲基化状态的动态性改变,包括核心启动子调控区域与非核心启动子调控区; 一般的,在高密度CpG区域趋向于非甲基化状态,在低密度CpG区域趋向于甲基化状态;因此,将对全基因组CpG富集区域分情况讨论,并做细致划分和统计。
不同细胞样本CpG分布特征分别在>=10倍覆盖度区域的全部基因组(ALL),HCP,LCP,HCNE,DMR,LTR,LINE,SINE以及其他区域分别进行讨论分析,
<1>. high-CpG-density promoters (HCPs), 即高密度CpG启动子区;
<2>. Low-CpG-density promoters (LCPs) 低密度CpG启动子区;
<3>. Highly conserved non-coding element (HCNEs) 高保守非编码区;
<4>. Differential methylated regions (DMR) 差异甲基化区;
<5>. Long terminal repeats (LTR) 长末端重复;
<6>. Long interspersed elements (LINE) 长分散元件;
<7>. Short interspersed elements (SINE) 短分散元件;
图例-1 全基因组CpG富集度与甲基化水平分布统计。(上)横坐标是甲基化水平(%),纵坐标是CpGs所占比例(%) ; (下)中纵坐标表示CpG密度(%)
(2) 针对不同CpG富集区域下的DNA甲基化模式与染色质组蛋白修饰模式关联分析
不同细胞发育时期或状态之间对比不同CpG富集区内甲基化水平(%),同时比较染色质修饰状态因素与甲基化水平的关联,或与细胞发育时期、细胞状态的关联(例如图例-2a;对ES和NPC细胞对比下,HCP区域甲基化水平的对比中,分不同的染色质修饰状态讨论:包括k4me3->k4me3,k4me3-> k4me2,k4me3->None,Bivalent->Bivalent,Bivalent->ke4m2,Bivalent->k4me2/k27me3,Bivalent->k27me3,Bivalent->None; 图例-2b,在HCP 区域外CpG甲基化水平,探索组蛋白甲基化在不同细胞时期之间的相关性(正或负相关)。图例-2c, HCNE的非CpG区域上甲基化水平,染色质修饰关系:包括k4me2->k4me2,k4me2->None, None->k4me2, None->none; 所有具有染色质修饰状态改变的位点上甲基化水平pair-wise比对显著性通过Mann-Whitney U 检验计算。
图例-2 DNA甲基化模式与染色质组蛋白修饰模式关联分析
(3) 分析在高度保守的编码序列上甲基化的改变情况
给出关键基因loci附近的CpG甲基化水平与哪些染色质修饰状态相关;另外,分析Bivalent效应是否存在;
图例-3 DNA甲基化,染色质组蛋白修饰与基因激活相关性分析
例如参看图例-3:ES和NPC对比H3K4me3,H3K4me2,H3K4me1,H3K27me3状态对比。对于神经分化因子基因loci, 非甲基化的CpG富集启动子区是在ES细胞中显示bivalent特性,且非激活状态;在NPC中,将恢复到单一状态(univalent)的H3K4me3,基因因此得到激活。H3K4me2富集出现在距离分化因子基因Olig2,Olig1 loci较远的HCNE区域上,并且显示与CpG去甲基化相关。红色,黄色和绿色分别表示甲基化的高,中,低水平;
(1)采用RNA Pol II在启动子上的结合丰度,以及表达谱芯片共同分析基因的表达活性水平,那么基于MeDIP-promoter Tilling Array ,或者基于二代测序获得的RNA Pol II 结合数据,可分析RNA Pol II与甲基化水平位点的对应情况;并同样按照甲基化CpG富集度区域划分对RNA Pol II进行考察(参看图例-4)。
图例-4 根据CpG含量将启动子分类:CpG贫瘠区,CpG弱富集区和CpG富集区启动子
(2)如果获得基因启动子序列,可以对启动子按照CpG含量进行分类,区分出CpG贫瘠区,CpG弱富集区,以及CpG富集区启动子图例-4 根据CpG含量将启动子分类:CpG贫瘠区,CpG弱富集区和CpG富集区启动子
(3) 在3类CpG富集度启动子序列上可分别通过Scatter Plot统计出DNA甲基化水平与CpG含量之间的关系(图例-5);对激活(具有Pol II结合的)启动子,可以分析其DNA甲基化水平和启动子密度之间的关系,进而探索分析含有不同CpG含量的启动子的活性(图例-6)
(4) 对组蛋白修饰状态下的CpG富集度和基因活性进行考察,在3类CpG富集度启动子序列上可考察Pol II的结合性,并将其模式与组蛋白修饰特性进行关联。
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