概述
iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantitation)技术是一种多肽体外标记技术。该技术采用4-plex或8-plex同位素的标签,通过特异性标记多肽的氨基基团,进行LC-MS/MS分析,可同时比较多种不同样本中蛋白质的相对表达含量。TMT技术是一种多肽体外标记的方法,采用2-plex、6-plex或10-plex同位素的标签,通过特异性标记多肽的氨基基团,然后进行串联质谱分析,可同时比较2组、6组或10组不同样品中蛋白质的相对含量。
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- 具有多个标签可同时标记最多8个样品进行差异分析。
- 是一种体外标记技术,可标记动物,植物,微生物,体液,细胞等多种样本。
- 不同标签混合后上机,具有较好的平行性,避免了技术误差,同时也提高了检测效率。
- 与凝胶方法相比,该技术还能发现膜蛋白,核蛋白,胞外蛋白,强碱和强酸蛋白以及小于10kD和大于200kD的蛋白,对低丰度蛋白亦有较好的检出率。
- 报告离子相对分子质量较低(113-121),质谱在低分子量区域具有更为准确和灵敏的信号输出,使检测结果精确可靠。
科学方案设计
实验流程
iTRAQ(Isobaric Tag for Relative Absolute Quantitation)和TMT(Tandem Mass Tags)技术是分别由美国AB Sciex公司和Thermo Fisher公司研发的多肽体外标记定量技术。这两种技术采用多个(2-10)稳定同位素标签,特异性标记多肽的氨基基团进行串联质谱分析,能够同时比较多达10种不同样本中蛋白质的相对含量,可用于研究不同病理条件下或者不同发育阶段的组织样品中蛋白质表达水平的差异。
对于可以传代的细胞样品来说,我们可以采取SILAC的方法完成对于细胞蛋白质组的标记过程,但是许多其他研究体系,比如组织样品以及不能进行传代培养的细胞来说,需要其他的标记方法来完成定量蛋白组学分析。iTRAQ等基于体外(in vitro)标记的定量方法应运而生。来自不同样品的同一肽段经TMT/iTRAQ试剂标记后具有相同的质量数,并在一级质谱检测(MS1)中表现为同一个质谱峰。当此质谱峰被选定进行碎裂后,在二级质谱检测(MS2)中,不同的报告基团被释放,它们各自的质谱峰的信号强弱,代表着来源于不同样品的该肽段及其所对应的蛋白的表达量的高低。TMT/iTRAQ定量蛋白组学研究因其测定精准度高适应样品种类多,目前已有很广泛的应用。百泰派克在传统的TMT/iTRAQ分析技术的基础上,提供TMT/iTRAQ/MultiNotch MS分析技术,使用三级碎片报告离子进行定量,可进一步提高TMT/iTRAQ定量蛋白组学分析的精度,进一步提高定量准确性。
iTRAQ同位素标记定量的原理
iTRAQ试剂可以标记酶解后的肽段,可与氨基酸的N端及赖氨酸侧链连接的胺标记同重元素。在质谱图中,任何一种iTRAQ试剂标签标记的不同样本中的相同肽段都表现为相同的质荷比。研究的样品经过iTRAQ试剂标记混合后,经过LC-MSMS高分辨质谱分析时,来源不同的相同蛋白样品在一级质谱上表现相同,Balance group在二级质谱发生中性丢失,Reporter group 在二级质谱产生2个报告离子,分别是114和117, 通过分析报告离子的峰强度比值就可以分析同一个蛋白在不同样品间的表达量比值。
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