三色多重荧光免疫组化染色试剂盒（抗兔二抗）

原理介绍: 酪酰胺信号放大(TSA， Tyramide signal amplification)技术是一类利用辣根过氧化酶（ HRP） 对靶蛋白进行标记的酶学检测方法， 类似常规免疫组化的 DAB 显色方法 ， TSA 技术同样采 用 HRP 标记的二抗， 同样有对应的 “显色”步骤 （HRP 催化加入反应体系的酪胺荧光素底物， 产生  活化荧光底物， 活化底物可与抗原上的酪氨酸等残基共价结合， 使样品上稳定的共价结合酪胺荧光    素。之后用热修复法洗去非共价结合的一抗-二抗-HRP 复合物， 重复下一种一抗-hrp二抗来第二轮孵 育， 换另一种酪胺荧光素底物， 如此往复就可实现多重标记。
TSA 详细原理是利用酪胺 Tyramide的过氧化物酶反应(酪胺盐在 HRP 催化 H202 下形成共价键结合位点)， 产生大量的酶促产物， 该产物能与周围的蛋白残基(包括色氨酸、  组氨酸和酪氨酸残基)结合， 这样在抗原-抗体结合部位就有大量的荧光素沉积， 结果使其检测信号得到 10-100 倍增强。  简单来说， 用这种方法做多重免疫荧光是利用二抗上带有的 HRP （而不是直接偶联荧光素） ， 来催化后续  添加入体系的非活性荧光素。  荧光素在 HRP 和过氧化氢的作用下被活化， 跟临近蛋白的酪氨酸残基共价偶联， 使得蛋白样品与荧光素稳定结合。  然后微波或煮沸或者水浴等热修复处理，前一轮非共价  结合的抗体被洗掉， 共价结合的荧光素稳定共价结合在样本切片蛋白上。  再换个一抗来第二轮孵育 ， 周而复始。  等到所有抗体孵育结束， 荧光素都结合好后， 最后去检测结果。  由于每次体系中都只有单  一抗体孵育， 因此无需担心抗体交叉反应，以及一抗二抗种属匹配问题， 大大减少了实验设计时不同  种属抗体选择匹配的限制。  也就是说， 如果用 TSA 技术， 同一张片子上所有的靶标都可以选用特异性 高的兔单克隆抗体。  搭配同一支抗兔的 HRP 二抗就可以进行实验， 而且信号放大的倍数大大增强。     本公司开发的试剂盒具体酪胺荧光染料为以下其中一种或者多种：  TYR-480， TYR-520， TYR-570 ，    TYR-620， TYR-690， TYR-780， TYR-488， TYR-CY3.此试剂盒中的荧光染料可单独或配合使用。  可以实现单标、双标、三标以及更多重荧光放大/多重同源抗体荧光标记等功能，极大丰富了此试剂盒的内涵。

试剂盒组成： TYR-488 荧光染料(绿光)(即用型， 5mL),-20℃；  TYR-CY3 荧光染料 （红光）  (即用型， 5mL)， -20℃；   TSA+增强剂， 100ul，  -20℃ （可选） ；
高敏多聚 hrp 山羊抗兔二抗 （5mL） 4℃。
备注：  TYR-488 荧光染料 、TYR-CY3 荧光染料 在-20 度下， 均为固体， 使用之前需解冻。

TSA+增强剂使用方法：  TSA+增强剂能够进一步增强荧光信号放大液的放大信号 5-10 倍， TSA+增 强剂：  TYR 荧光放大液=1:500， 使用 TSA+增强剂不是必须的选项， 可以根据具体的情况选择添加或者不选择添加。
操作流程：
1、 石蜡切片脱蜡至水：  依次将切片放入二甲苯 Ⅰ 15min-二甲苯Ⅱ15min-无水乙醇 Ⅰ5min-无水乙醇 Ⅱ。 取出放在通风厨内， 酒精晾干后放入自来水中稍洗， 蒸馏水洗。
2、 抗原修复：  组织切片置于盛满 PH 9.0 EDTA 碱性抗原修复液或者 PH6.0 柠檬酸修复缓冲液的修复 盒中于微波炉内进行抗原修复 （也可以用高压 1-2min 100 度水煮 15min 95 度水浴 20min等其他 热修复方法）  。 中火 8min， 停火 8min， 转中低火 7min， 此过程中应防止缓冲液过度蒸发， 切勿 干片。  自然冷却后将玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次， 每次 5min。 (修复液 和修复条件根据组织类型以及抗原类型来确定）  。
3 、 阻断内源性过氧化物酶：  切片放入 3%过氧化氢溶液， 室温避光孵育 15 min， 将玻片置于 PBS （PH7.4） 中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次， 每次 5min。
4、 BSA 封闭:切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈 （防止抗体流走） ， 在圈内滴加用 3%BSA-PBS （或者其他封闭液） 均匀覆盖组织， 室温封闭 30min。
5、 加一抗：  轻轻甩掉封闭液， 在切片上滴加用抗体稀释液稀释好的的一抗 X， 切片平放于避光湿盒 内 4°C 孵育过夜或者 37 度 1-2h。 （湿盒内加少量水防止抗体蒸发）
6、 加 hrp 二抗：  玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次， 每次 5min。 切片稍甩干后 在圈内滴加与一抗相应种属的hrp二抗覆盖组织， 避光室温孵育 50min， PBS 洗三次。
7、 荧光染料反应：  TYR-488 荧光染料 （或者 TYR-CY3 荧光染料） 反应 10-15min， PBS 洗三次。
8、 重复 2-7 步骤 （换用另外一种 TYR 荧光染料）
9、 DAPI 复染细胞核：  玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次， 每次 5min。 切片稍 甩干后在圈内滴加 DAPI 染液， 避光室温孵育 10min。
10、    封片：  玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次， 每次 5min。 切片稍甩干后用抗 荧光淬灭封片剂封片。
11、    镜检拍照：  切片于荧光显微镜/共聚焦/多通道荧光扫描仪/多光谱成像系统下观察并采集图 像。

染料 激发波长 发射波长
DAPI 蓝色 350 420
TYR-480 450 480
TYR-488 绿色 480-490 512-520
TYR-CY3 红色 530-550 570-590
TYR-520 绿色 490 520
TYR-570 红色 550 570
TYR-620 590 620
TYR-690 630 690
TYR-780 750 780

文 章 引 用 试 剂 盒 / 方 法：  Staining  of A  and  B was  performed  using  a Three-color Immunofluorescence kit ( GuduoBio  Biological Technology, Shanghai, China) based on the  tyramide  signal  amplification  (TSA)  technology  according to  the  manufacture’s instruction.