三色多重免疫荧光试剂盒（双标三色）

原理介绍: 酪酰

多重荧光免疫组化试剂盒使用说明

（以三标四色为例）

原理介绍： 酪酰胺信号放大(TSA，Tyramide signal amplification)技术是一类利用辣根  过氧化酶（ HRP）对靶蛋白进行标记的酶学检测方法 ，类似常规免疫组化的  DAB 显色方   法 ，TSA 技术同样采用  HRP 标记的二抗 ，（HRP)催化加入反应体系的酪胺荧光素底物， 产生活化荧光底物 ，活化底物可与抗原周围大量的蛋白残基共价结合 ，如此在抗原-抗体结  合部位就有大量的荧光素沉积产生信号放大的效果（与普通荧光相比 ， 该方法信号放大增  强 10-100 倍  ）。之后可用微波修复的方法洗去非共价结合的一抗/二抗-HRP 复合物，再  换另一种酪胺荧光染料重复实验染下一个标志物 ， 如此往复就可实现多重标记。等到所有  抗体孵育结束 ，荧光素都结合好后 ，最后扫描成像。

由于每次体系中都只有单一抗体孵育，因此无需担心抗体交叉反应，以及一抗二抗种属匹配 问题，大大减少了实验设计时不同种属抗体选择匹配的限制。因此使用 TSA 技术 ，同一张 片子上所有的靶标都可以选用特异性高的兔单克隆抗体搭配同一支抗兔的  HRP 二抗就可   以进行实验 ，而且信号放大的倍数大大增强。

普通荧光法      VS     TSA

 

 

 

 

本公司提供的试剂盒酪胺荧光染料为以下其中一种或者多种组合：    GD-480， GD-520，

GD-570， GD-620， GD-670 ， GD-780。此试剂盒中的荧光染料可单独或组合使用。 可以实 现单标、双标、三标、甚至六标的荧光放大/多重同源抗体荧光标记等功能。

备注 ：购买前请确认荧光扫描仪通道是否与对应的染料波长匹配。

D-480， GD-520，

GD-570， GD-620， GD-670 ， GD-780

。荧光染料长期-20 保存，短期 4℃保存 ， 推荐稀释浓度 1： 100 ，如实验结果表达较高 ，可根据具体情况调整稀释比例为 1： 150 或者 1 ：200。

实验流程如下：

具体实验步骤：

石蜡切片具体实验步骤：

1、烤片 ：切片放入可调节恒温箱 ，常规组织 60℃烤片  1h（特殊样本特殊条件）。

2、脱蜡 ：依次将切片放入二甲苯 Ⅰ15min→二甲苯Ⅱ15min →无水乙醇 Ⅰ5min  →无水 乙醇Ⅱ → 95% 酒精  5 min →  70% 酒精  5 min  →水冲洗  5min*2。

3、抗原修复 ：组织切片置于盛满  PH 9.0 EDTA  碱性抗原修复液或者  PH6.0 柠檬酸修复  缓冲液的修复盒中于微波炉内进行抗原修复。煮沸后（约  3min），转中/低火加热  15~20 min（中间注意补液，防止玻片干燥）。待自然冷却后将玻片置于 TBST/PBST 缓冲液中摇 洗  3 次 ，每次  3min。 (修复液和修复条件根据组织类型以及抗原类型来确定）。

4、 阻断内源性过氧化物酶 ：擦干组织周围的水分 ，用免疫组化笔画阻水圈 ，滴加  3%过氧 化氢 ，室温孵育  10 分钟后 ，TBST/PBST 缓冲液中摇洗  3min x3。

5、封闭 ：轻轻甩干水分后 ，在阻水圈内滴加封闭液均匀覆盖组织 ，室温封闭 10~20min。轻轻甩掉多余封闭液 ，勿洗。

6、加一抗 ：在切片上滴加用抗体稀释液稀释好的一抗 X ，切片平放于避光湿盒内 4°C 孵  育过夜或者  37 度  1-2h（湿盒内加少量水防止抗体蒸发） 。TBST/PBST 摇洗  3min x3。

7、加  HRP 二抗 ：轻轻甩干水分后 ，在圈内滴加与一抗相应种属的  HRP 二抗覆盖组织 ， 37℃孵育  10min~60min（推荐  20min，具体温度和时间按预实验条件做），TBST/PBST 摇洗  3min x3。

8、配置荧光染料工作液和染料孵育：使用染料稀释液按照  1 ：100 稀释染料原液，滴加稀 释后的荧光染料工作液反应  10-15min ，TBST/PBST 摇洗  3min x3 。

如需要染下一个标志物 ，重复  3-8 步骤（更换另外一种荧光染料）。

9、含  DAPI 封片剂封片 ：切片稍甩干后使用含  DAPI 染料的封片剂进行封片 ，最后可用 指甲油固定盖玻片。

10、 成像/全景扫描 ：切片于荧光显微镜/共聚焦/多通道荧光扫描仪/多光谱成像系统下观

察并采集图像。

 

染料	激发波长	发射波长
DAPI	350	460
GD480	440	480
GD520	500	520
GD570	550	570
GD620	590	620
GD670	650	670
GD780	750	780

文 章  引 用 试 剂 盒 / 方 法 ：

Co-staining of A, B and C was performed using a Four-color Fluorescence kit ( Guduo bio Biological Technology, shanghai, China) based on the tyramide signal amplification (TSA) technology according to the manufacture’s instruction