NK细胞高效扩增试剂盒 Human NK cell rob

产品名称：NK细胞高效扩增试剂盒  Human NK cell robust expansion kit
产品简介
NK细胞高效扩增试剂盒  Human NK cell robust expansion kit适用于从人新鲜或冻存的外周血、脐血、浓缩白细胞来源的单个核细胞在体外扩增成NK细胞，起始单个核细胞经过14天培养，总细胞数可以扩增约50倍左右，NK细胞数可以扩增500倍以上，且纯度可达70%-85%（由于个体差异有的样品诱导后NK细胞纯度低于70%或高于85%）
产品优势
  成份明确，无异源成份
  无菌、无支原体、低内毒素
  纯因子法培养
  同时适用于脐血与外周血
  14天培养后，细胞活率在90%以上
  纯度较高，14天培养后大多样本纯度可达70-85%
操作步骤：
一 血浆的提取与保存
注意：
1）禁止使用 EDTA 抗凝的血样，因为 EDTA 会极大影响 NK 细胞的激活与增殖；
2）所取血样最好不超过 12 小时，因为血样的时间越长，所提取的 PBMC 中杂细胞越多，且 PBMC 的活性会降低；
1.将取到的外周血置于 50mL 离心管中，室温下 650g，离心 15min；
2.取上层黄色血浆部分于新的 50mL 离心管中（下层为血液细胞成分，用于后续单个核细胞的提 取）；
3.将血浆置于 56°C 水浴锅中灭活 30min；
4.血浆灭活完毕后，可见血浆呈现浑浊状，900g，离心 10min；
5.取上清，于-20°C 冷冻 15min；
6.冷冻完毕后，再次 900g，离心 10min，取上清，于 4°C 保存待用。
二 单个核细胞的提取
1.取血浆提取步骤的下层红色细胞沉淀，加入生理盐水或 PBS 至原体积；
2.取 2 支 50mL 离心管，分别加入 15mL 淋巴细胞分离液，并将 1 步骤中的稀释血液分别缓缓 铺加到淋巴细胞分离液的上层； 注意：铺加血样时建议速度适中，尤其是刚开始时的铺加， 避免破坏淋巴细胞分离液与血样的 界面。
3.室温下，800g 离心 20min（无闸减速）；
4.离心后，离心管中样品由上到下分为 4 层：血浆层-白膜层-人淋巴细胞分离液层-红细胞与粒 细胞的沉淀。分别小心吸取白膜层及其以下约一半的液体于新的离心管中，并加入生理盐水或 PBS 至 40mL 体积，混匀，300g 离心 10min；
5.弃上清，沉淀再次用 40mL 的生理盐水或 PBS 重悬，300g 离心 10min；
6.弃上清，沉淀少许 NK-IV 培养基重悬，合并，取部分细胞悬液计数，备用。
三 单个核细胞接种与补液
1.T75 瓶包被 将 7mL PBS 加入到 T75 细胞培养瓶中，再将 NK-I 加入到 T75 瓶中，充分混匀 后，将细胞培养瓶水平静置于二氧化碳培养箱 37°C 孵育 2h（不能低于 1h）。孵育完毕后，吸去 包被液，再用 10mL PBS 轻柔摇晃洗涤细胞培养瓶，弃去清洗液待用；
2.第0天，配制50mL NK细胞完全培养基：NK-IV培养基45mL，10%已热灭活的自体血浆（5mL）， NK-II 300μL，NK-III 250mg（NK-III 为每支 500mg，用 1mL NK-IV 培养基溶解，取一半用于 本试剂盒）以及 IL-2（完全培养基中 IL-2 终浓度为 1000IU/mL），将制备好的单个核细胞（MNC） 按 1-1.5M cells/mL 的细胞密度接种于已包被的含有 50mL NK 细胞完全培养基的 T75 瓶中；
4.第 5 天，往培养袋补加 NK-IV 培养基 150mL，1%已热灭活的自体血浆 1.5mL 以及 IL-2（IL-2 终浓度为 1000IU/mL），此时袋子含 300mL 培养液；
5.第 7 天，往培养袋补加 NK-IV 培养基 300mL，剩余的所有自体热灭活血浆以及 IL-2（IL-2终浓度为 1000IU/mL），然后分成两袋，此时每个袋子含 300mL 培养液；
6.第 9 天，分别往每个培养袋补加 NK-IV 培养基 300mL 以及 IL-（2 IL-2 终浓度为 1000IU/mL）， 此时每个袋子含 600mL 培养液；
7.第11天，分别往每个培养袋补加NK-IV培养基400mL以及IL-2（IL-2终浓度为1000IU/mL）， 此时每个袋子含 1000mL 培养液； 8.第 13 天，或 14 天，收获 NK 细胞。
实验数据