Annexin V-APC/7-AAD荧光双染细胞凋亡检测试

Annexin V-APC/7-AAD荧光双染细胞凋亡检测试剂盒产品概述

     Annexin V-APC／7-AAD荧光双染细胞凋亡检测试剂盒用于鉴定凋亡和坏死细胞。
      Annexin V是一种钙离子依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸PS有高度亲和力，可通过细胞外侧暴露的PS与凋亡早期细胞胞膜结合，将Annexin V标记荧光染料APC利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡。
      7-AAD可与双链DNA特异性结合，并产生强烈的荧光，正常情况下无法透过细胞膜。由于凋亡晚期或坏死细胞膜丧失完整性，7-AAD可进入细胞内对DNA进行染色，与Annexin V搭配使用，可区分处于不同凋亡时期的细胞。
      本试剂盒检测喜树碱诱导的Jurkat细胞凋亡效果如下图所示：

产品使用说明：
      本试剂盒中Annexin V Binding Buffer(10×)为10×浓缩液，实验前用去离子水稀释成1×工作液。
例如：取1mL Annexin V Binding Buffer(10×)，加入去离子水定容至10mL即可。

实验操作指南步骤：
      1. 细胞按照实验方案进行凋亡诱导，300g离心5min，弃上清，收集细胞，PBS洗涤细胞一次，轻轻重悬细胞并计数。
      注：本品仅在悬浮培养的细胞中验证，良好的细胞状态是实验的关键。贴壁生长的细胞用于凋亡检测时，可能会因为胰酶消化、吹打等处理导致细胞的坏死或凋亡，对实验结果可能存在不可控的影响，请谨慎处理。
      2. 取1-5×10^5重悬的细胞，300g离心5min，弃上清。用PBS洗涤细胞一次，离心后弃上清，加入500μL稀释的1×Annexin V Binding Buffer工作液重悬细胞。
      3. 细胞悬液中加入5μL的Annexin V-APC和5μL的7-AAD染色液。
      4. 轻柔涡旋混匀后，室温避光孵育15-20min。
      5. 反应完成后立即上机检测。如不能及时检测，请于冰上避光静置并于1小时内完成检测。

保存条件：
      Annexin V-APC和7-AAD染色液需要避光保存；7-AAD染色液适当分装后-20℃可保存1年，其他试剂4℃可保存1年。

注意事项：
      1. 为获得最佳的使用效果，请在3-6个月内使用，Annexin V-APC禁止冷冻保存；
      2. 染色后宜尽快检测，时间过长可能会导致凋亡或坏死细胞的数量增加；
      3. 荧光物质均易发生淬灭，在进行荧光观察时，尽量缩短观察时间，同时在操作和存放过程中也尽量注意避光保存；
      4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

 
Annexin V-APC/7-AAD荧光双染细胞凋亡检测试剂盒(本试剂产品仅供科学研究或进一步生产使用，不可用于临床诊断或治疗)

1、 细胞传代：
1）细胞生长至覆盖培养瓶的 80%面积时，弃 25cm2 培养瓶中的培养液，用 PBS 清洗细胞一次；
2）添加 0.25%胰蛋白酶消化液约 1ml 至培养瓶中，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后加入 5ml 完全培养
液终止消化，再轻轻吹打细胞使之脱落，然后将悬液转移至 15ml 离心管中， 1000rpm 离心 5min；
3）弃上清，沉淀细胞用 1-2ml 完全培养基重悬，然后按 1:2 比例进行分瓶传代，最后放入 37℃， 5%CO2 细胞
培养箱中培养；

2、 细胞冻存：
1）细胞生长至覆盖培养瓶的 80%面积时，弃 25cm2 培养瓶中的培养液，用 PBS 清洗细胞一次；
2）添加 0.25%胰蛋白酶消化液约 1ml 至培养瓶中，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后加入完全培养液终
止消化，轻轻吹打细胞使之脱落，然后将悬液转移至 15ml 离心管中， 1000rpm 离心 5min；
3）用适量的冻存液（FBS： DMSO=9 ： 1）重悬细胞，并放置于冻存管中；
4）先将细胞冻存管放置于-20℃ 1.5h，然后将其移入-80℃过夜， 24h 后转入液氮中进行长期保存。使用程序
降温盒可直接放入-80℃。

3、细胞复苏：
1）从液氮中取出细胞冻存管（注意：佩戴防爆管面具），快速将其置入 37℃水浴中解冻，直至冻存管中无结
晶，然后用 75%的酒精擦拭冻存管外壁；
2）将冻存管中的细胞移至含 6ml 完全培养基的 15ml 离心管中， 1000rpm 离心 5min；
3）弃上清，沉淀用 6ml 完全培养基重悬，接种 25cm2 培养瓶，于 37℃， 5%CO2 细胞培养箱中培养

Annexin V-APC/7-AAD荧光双染细胞凋亡检测试剂盒