T4DNA连接酶

T4DNA连接酶

T4 DNA Ligase说明书
货号：T1410
储存条件：-20℃保存，避免反复冻融，10×T4 DNA Ligase Buffer建议分装使用。
浓度：3U/μL
来源：重组大肠杆菌
产品内容：

T4 DNA Ligase	60U
10×T4 DNA Ligase Buffer	30μL

产品说明：
该酶在以ATP做辅酶的情况下，可以催化相邻DNA链的5'-磷酸集团和3'-羟基之间的链接反应。平末端和粘性末端均可。此酶液可以催化双链RNA与双链DNA连接，但不能催化单链核酸的连接。
活性单位定义：
1个Weiss活性单位是指在ATP-PPi交换反应中，37℃、20min内将1nmol[32PPi]转换为Norit可吸收形式所需的酶量。1个Weiss活性单位相当于约200个粘性末端连接单位。1个粘性末端连接单位：20μL反应体系（50mM Tris-HCl pH7.5），10mM MgCl2，10mM DTT,1mM ATP,25μg/ml BSA,0.12μM (300μg/ml的5'DNA末端)中，在16℃、30min内50%连接Hind III酶切的Lambda DNA 产物所需要的酶量。
使用示例：

1. 先将10×T4 DNA Ligase Buffer 在冰上融化，并进行短暂的离心。
2. 以10μL连接体系示例，在微量离心管中加入以下各种成分：

组成成分	体积
目的DNA片段	约0.1pmol
载体DNA	约0.01pmol
10×T4 DNA Ligase Buffer	1μL
T4 DNA Ligase	0.5-1μL
ddH2O	补足至10μL

 

3. 16℃连接过夜。
4. 将3-5μL连接产物转化至100μL感受态细胞中。

注意事项：

1. 载体DNA和连接片段的摩尔比：对于不同的载体和DNA片段，要取得成功的连接，应分别建立具有不同摩尔数比例的连接反应，在大多数情况下，DNA片段的摩尔数应控制在载体DNA摩尔数的3-10倍。
2. 10×T4 DNA Ligase Buffer中含有ATP，为避免ATP的降解，建议解冻后分装冻存于-20℃。
3. 平末端的载体与DNA片段连接时，应首先对载体进行去磷酸化，以防止载体自身环化。

注意：如果向反应体系中加入PEG可以促进平末端的连接，但PEG可能导致cDNA片段克隆产物出现串联体并抑制包装的反应。
附：
10×T4 DNA Ligase Buffer：400mM Tris-HCl pH7.8），100mM MgCl2，100mM DTT,5mM ATP。
储存buffer：20mM Tris-HCl(pH7.5)，50mM KCl，0.1mM EDTA，1mM DTT,50%（v/v）甘油。