MM.1S 人多发性骨髓瘤细胞

　　细胞描述

　　该细胞系的母细胞株MM.1是从一位对类固醇疗法产生抗药性的多发性骨髓瘤患者的外周血中建立的。MM.1R对地塞米松耐药。近缘细胞系MM.1S也是从MM.1中分离出来的，但对地塞米松敏感。该细胞复苏后需要两周左右才能恢复正常生长。

　　细胞特性

　　1）来源：人、女性、外周血

　　2）形态：成淋巴瘤细胞，悬浮和轻微的贴壁

　　3）含量：>1x106

　　4）污染：支原体、细菌、酵母和真菌检测为阴性

　　5）规格：T25瓶或者1mL冻存管包装

　　6）用途：仅供科研使用。

　　运输和保存

　　干冰运输及复苏好存活细胞

　　（1）1mL冻存管包装干冰运输，收到后-80度冰箱保存过夜后转入液氮或直接复苏，若发现干冰已挥发干净、冻存管瓶盖脱落、破损及细胞有污染，请立即与我们联系。

　　（2）T25瓶复苏的存活细胞常温发货，收到后按照细胞接收后的处理方法操作。

　　细胞接收后的处理

　　1）收到细胞后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染，请拍照后及时联系我们。

　　2）请在4或5X显微镜下确认细胞状态，同时给刚收到的细胞拍照（10×，20×）各2-3张以及培养瓶外观照片一张留存，作为售后时收到时细胞状态的依据。

　　3）悬浮细胞：T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，然后抽出瓶中的培养基和细胞在1000RPM条件下离心5min，弃去上清重悬后接种到新的培养瓶中（加入按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基）。

　　4）半贴细胞（或贴壁不牢细胞）：T25瓶置于37℃培养箱中约2-3h，显微镜下观察细胞的情况，若细胞密度在70%以下，客户需收集T25瓶中的悬浮的细胞离心后用完全培养基重悬后打回到原来的培养瓶中继续培养，若细胞生长到70%-90%可以对细胞进行传代，在传代过程中，需要收集T25瓶中悬浮的细胞离心后回收。

　　5）备注：运输用的培养基（灌液培养基）不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。收到细胞后第一次传代建议T25培养瓶1：2传代。

　　细胞培养步骤

　　一．培养基及培养冻存条件准备：

　　1）准备1640基础培养基,优质胎牛血清10%，P/S青霉素-链霉素1%

　　2）注意事项：

　　a.该细胞同时存在悬浮生长和轻微的贴壁状态。

　　b.该细胞复苏后需培养2周左右时间，才能恢复正常生长状态。

　　c.细胞密度不可过高，在细胞汇合前进行传代，否则容易成团。

　　3）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

　　参考传代比例:1:3-1:6，参考换液频率:2-3天

　　4）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

　　二．细胞处理：

　　复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入T25培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度和拍照。

　　2细胞传代：如果细胞密度达70%-90%，即可进行传代培养。

　　该细胞为悬浮和轻微的贴壁细胞，传代可以参考以下方法：

　　1）悬浮状态下生长的细胞，可以通过向培养瓶中添加完全培养基来维持细胞的生长状态，一般情况下细胞密度维持在1×105~1×106个/mL（不同细胞对密度要求不同，具体可以参考细胞说明书）可以维持细胞的正常生长。悬浮细胞的收集：将培养瓶中的悬浮的细胞收集到离心管中。弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

　　2)．贴壁细胞的的消化，pbs清洗1-2次由于细胞贴壁不牢，pbs清洗过程中会有细胞脱落，所以pbs清洗液需要收集到离心管中。清洗后的贴壁细胞按正常的贴壁细胞处理。加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53mMEDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%血清的培养基来终止消化。

　　3）将收集到的悬浮细胞，消化下贴壁细胞和pbs清洗液中的细胞以1000rpm,5min离心重悬混匀后将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

　　3细胞冻存：收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。

　　下面T25瓶为例；

　　1．细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入3-4ml含10%血清的完全培养基来终止消化，收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×106~1×107个活细胞/ml。

　　2．1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞，按每1ml冻存液含1×106~1×107个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。

　　3．将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。