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- 2025年11月05日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 库存：
100
- 英文名：
West Nile Virus(WNV) SYBR qRT-PCR Kit
- 保质期：
1年
- 供应商：
优利科（上海）生命科学有限公司
- 保存条件：
-20℃
- 规格：
50T
西尼罗病毒染料法荧光定量 RT-PCR 试剂盒产品及特点
西尼罗病毒(West Nile Virus，WNV)是一种 RNA 病毒，西尼罗河病毒感染的潜伏期一般为 3～12 天。绝大多数为隐性感染，不出现任何症状，少数人表现为西尼罗河热，病人出现发热、头疼、肌肉疼痛、恶心、呕吐、皮疹、淋巴结肿大等类似感冒症状，极少数人感染后表现为西尼罗河病毒性脑炎、脑膜脑炎和脑膜炎，因此快速准确鉴定对该病的预防和检疫有着重要作用。本产品基于 PCR 原理开发。它具有下列特点：
规格及成分
运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。阳性对照需要因易污染其他成分需
要单独放置。本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供 RNA 片段作为阳性对照。
自备试剂
样品 RNA
使用方法
一、稀释阳性对照（以 10E2-10E7 这 6 个 10 倍稀释度为例。由于标准品浓度非
常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原。
1. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。用带芯枪头分别加入 45 μL 荧
光 PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。
二、样品 RNA 的制备
注:需使用 ROX 染料 I 的机型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、 Step-One、Step-One Plus。
需使用 ROX 染料 II 的机型：：ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research
的 Chromo4、Opticon（II）Corbett Rotor Gene 3000。
不需要使用 ROX 的机型：Thermal Cycle Dice Real Time System， LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene 3000、RotorGene 6000。
数据处理
西尼罗病毒(West Nile Virus，WNV)是一种 RNA 病毒，西尼罗河病毒感染的潜伏期一般为 3～12 天。绝大多数为隐性感染，不出现任何症状，少数人表现为西尼罗河热，病人出现发热、头疼、肌肉疼痛、恶心、呕吐、皮疹、淋巴结肿大等类似感冒症状，极少数人感染后表现为西尼罗河病毒性脑炎、脑膜脑炎和脑膜炎，因此快速准确鉴定对该病的预防和检疫有着重要作用。本产品基于 PCR 原理开发。它具有下列特点：
- 一站式，用于不需要单独准备每种成分，包括引物和对照。
- 根据西尼罗病毒的保守基因序列设计的引物，具有良好的特异性。
- 基于染料法 qRT-PCR 检测，灵敏度比常规 RT-PCR 高 10-100 倍，可以达到至少 1000 拷贝/反应。
- 使用一管式 qRT-PCR 技术，RT 和 PCR 两步在一个试管内完成，不需要中间转移样品，降低了操作误差和可能的污染。
规格及成分
| 成 份 | 十孔盒包装 |
| 2×qRT-PCR 缓冲液 | 500 μL（棕色管） |
| 10×qRT-PCR 酶混合液 | 100 μL（红盖） |
| ROX 染料I | 50 μL（棕色管） |
| ROX 染料 II | 50 μL（棕色管） |
| 荧光 PCR 专用模板稀释液 | 1mL（亮黄盖） |
| 西尼罗病毒 RT-PCR 引物混合液 | 100 μL（白盖） |
| 西尼罗病毒 RT-PCR 阳性对照 （1×10E8 拷贝/μL） |
50 μL（黄盖） |
| 核酸释放剂试用装 | 20 次（1mL，绿盖） |
| 使用手册 | 1 份 |
运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。阳性对照需要因易污染其他成分需
要单独放置。本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供 RNA 片段作为阳性对照。
自备试剂
样品 RNA
使用方法
一、稀释阳性对照（以 10E2-10E7 这 6 个 10 倍稀释度为例。由于标准品浓度非
常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原。
1. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。用带芯枪头分别加入 45 μL 荧
光 PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。
- 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(本试剂盒提供)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
- 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
- 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。
二、样品 RNA 的制备
- 如果有 N 个样品，必须设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 上步制备的阳性对照梯度稀释液中的第 4 号（浓度为 1×10E4 拷贝/μL，10μL 相当于 1 万拷贝）再加上一定量的水作为制备的阳性对照（加水后其总体积跟样品一样，样品体积多少取决于所用试剂盒的要求）。可以用水作为制备的阴性对照。
- 用自选方法纯化 N+2 个样品的 RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 RNA 提取试剂盒兼容。本试剂盒免费赠送 20 次免 RNA 提取的核酸释放剂试用装。
- 如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照，6 个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），1 个用于 PCR 阳性对照（用第 4 号阳性对照稀释液做模板）。下面只描述定量分析的步骤，定性分析只是把 6 个标曲反应缩减成 1 个，其余不变。
- 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设
| 成分 | N+2 个制备 所得样品 |
RT-PCR 阴性对照 |
RT-PCR 阳性 对照（2-7 管） |
| 2×qRT-PCR 缓冲液 | 10μL | 10μL | 各 10μL |
| 口蹄疫病毒 RT-PCR 引物混合物 |
2μL | 2μL | 各 2μL |
| 50×ROX (见注) | 0.4μL | 0.4μL | 各 0.4μL |
| 样品制备所得 RNA 模 板（来于第 8 步） |
5.6μL | 不加 | 不加 |
| 稀释所得 6 个阳性对照 | 不加 | 不加 | 各 5.6μL（2 号样 |
| （来于第 6 步） | 到 2 号管，3 号样 到 3 号管…） |
||
| 10×qRT-PCR 酶混合液 |
2μL | 2μL | 2μL |
需使用 ROX 染料 II 的机型：：ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research
的 Chromo4、Opticon（II）Corbett Rotor Gene 3000。
不需要使用 ROX 的机型：Thermal Cycle Dice Real Time System， LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene 3000、RotorGene 6000。
- 上机后按下面参数进行 RT-PCR（参数可能会因仪器不同而需优化）。
过程 温度 时间 RT（逆转录） 50℃ 15-30 分钟 预变性 94℃ 2 分钟
RT - PCR 反应
（30 个循环）95℃ 15 秒 60℃ 15 秒（采集 FAM 通道的荧光信号） 72℃ 15 秒 按仪器预设程序进行溶解曲线分析
数据处理
- 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 RNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。
- 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大
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技术资料西尼罗病毒染料法荧光定量 RT-PCR 试剂盒
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