尼帕病毒（NIPAH）核酸检测试剂盒（荧光-PCR法） 

【产品名称】
商品名称：尼帕病毒（NIPAH）核酸检测试剂盒（荧光-PCR法） 
Name  ：Nipah Virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包装规格】48T/盒

【预期用途】
尼帕病毒(Nipah virus， NiV)是一种新发现的副豁病毒，属于生物安全4级(BSL4)病毒。NiV可引起猪的呼吸道疾病和人的急性发热性脑炎,并且对人具有高度致死性，人感染NIV后死亡率高达40%-70%^[1]，且在2004年孟加拉国疫情中显示有人与人之间传播的可能性^[2]。近年来，疫情在东南亚一些国家，如马来西亚、孟加拉、印度等频频出现,引起人们高度关注。由于猪感染NiV后可大量繁殖和迅速传播此病毒，但症状并不明显，所以难以及时发现疫情，而我国又是养猪大国,因此NiV对我国构成严重威胁^[3]。
本试剂盒适用于检测的疑似感染动物或人的静脉血等标本中尼帕病毒，适用于尼帕病毒感染的辅助诊断。

【检验原理】
本试剂盒用一对尼帕病毒特异性引物，结合一条特异性荧光探针，用一步法荧光RT-PCR技术对尼帕病毒RNA进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。



【试剂组成】

名      称	规      格
酶液	50μL×1管
NIPAH反应液	1.0mL×1管
NIPAH阳性质控品	50μL ×1管
阴性质控品	250μL ×1管

注：
1）不同批号试剂不能混用。
2）试剂盒内各试剂组份足够包装规格所标示的检测次数。

【储存条件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过5次，有效期12个月。

【适用仪器】
ABI 、安捷伦MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf等系列荧光定量PCR检测仪。

【标本采集】
疑似感染动物或人的静脉血2mL至EDTA-2Na抗凝管。

【保存和运输】
上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过6个月，标本运送应采用2~8℃冰袋运输，严禁反复冻融。

【使用方法】

1. 样品处理（样本处理区）

1. 样本前处理

取上层血清100μL进行核酸提取。
 

2. RNA提取

推荐采用优利科（上海）生命科学有限公司生产的RNA提取试剂盒（离心柱提取法），请按照试剂盒说明书进行操作。
 

2. 试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照；样品每满7份，多配制1份)，每测试反应体系配制如下表：

试剂	NIPAH反应液	酶液
用量	20μL	1μL

将混合好的测试反应液分装到PCR反应管中，21uL/管。
 

3. 加样（样本处理区）

将步骤1提取的RNA、阳性质控品、阴性质控品各取4μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。
 

4. PCR扩增（核酸扩增区）

1. 将待检测反应管置于荧光定量PCR仪反应槽内；
2. 设置好通道、样品信息，反应体系设置为25μL；荧光通道选择： 检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）NONE，ABI系列仪器请勿选择ROX参比荧光，选择None即可。
3. 推荐循环参数设置：

步骤	循环数	温度	时间	收集荧光信号
1	1 cycle	42℃	20min	否
2	1 cycle	95℃	10min	否
3	40 cycles	94℃	15sec	否
		55℃	30sec	是

5. 结果分析判定

 

1. 结果分析条件设定

设置Baseline和Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节Baseline的start值(一般可在3~15范围内调节)、stop值(一般可在5~20范围内调节)，以及Threshold的Value值(上下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。
 

2. 结果判断

阳性：检测通道Ct值≤35，且曲线有明显的指数增长曲线；
可疑：检测通道35<Ct值≤38，建议重复检测，如果检测通道仍为35<Ct值≤38，且曲线有明显的增长曲线，判定为阳性，否则为阴性；
阴性：样本检测结果Ct值>38或无Ct值。
 

6. 质控标准

阴性质控品：Ct>38或无Ct值显示；
阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且Ct值≤32；
以上条件应同时满足，否则实验视为无效。
 

7. 检测方法的局限性

• 样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；
• 样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；
• 阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；
• 病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；
• 不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；
• 试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；
• 本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

【注意事项】

• 所有操作严格按照说明书进行；
• 试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；
• 反应液应避光保存；
• 反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；
• 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；
• 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；
• 实验完毕后用10%次氯酸或75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；
• 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

【参考文献】
[1] Chua KB, Bellini WJ, Rota PA, et al. Nipah Virus: a recently emergent deadly paramyxovirus [J]. Science, 2000, 288(5470):1432-1435.
[2] Harcourt BH, Lowe L, Tamin A, et al. Genetic characterization of Nipah virus, Bangladesh, 2004 [J]. Emerg Infect Dis, 2005, 11(10):1594-1597.
[3] 陈继明，王志亮，赵永刚，等。我国尼帕病毒风险与控制措施初步分析[J].中国动物检疫，2005，22（1）:42-44.