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- YLKBIO
- YLK-PCR0122
- 国产
- 2025年08月18日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 库存：
100
- 英文名：
Toxophasma gondiI Probe qPCR Kit
- 保质期：
1年
- 供应商：
优利科（上海）生命科学有限公司
- 保存条件：
-20℃
- 规格：
50T
产品及特点：
刚地弓形虫（Toxophasma gondii）简称弓形虫，弓浆虫。寄生于人和许多种动物的有核细胞，引起人畜共患的弓形虫病。特别是在宿主免疫功能低下时致病，属机会致病原虫。因此快速灵敏检测刚地弓形虫有重要意义。本产品就是为此目的根据 PCR 原理开发的试剂盒，它具有下列特点：
1. 即开即用，用户只需要提供样品 DNA 模板。
2. 引物和探针经过优化，灵敏性高。
3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4. 特异性高，引物是根据刚地弓形虫高度保守区设计，不会跟其他微生物 DNA 发生交叉反应。
5. 本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 PCR 反应。
6. 本产品只能用于科研。
规格及成分：
| 成分 | 包装 |
| 2×Probe qPCR MagicMix | 500 μL（本色盖） |
| 荧光 PCR 专用模板稀释液 | 1 mL（黄盖） |
| 刚地弓形虫探针法 qPCR 引物 混合液 |
100 μL（白盖） |
| 刚地弓形虫 qPCR 探针 | 100 μL（棕色管） |
| 刚地弓形虫探针法 qPCR 阳性 对照 (1×10E8 拷贝/μL) |
50 μL（黄盖） |
| 核酸释放剂（试用装） | 20 次（1mL，绿盖） |
自备试剂：样品 DNA。
使用方法：
一、稀释标准曲线样品（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原， 本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。
1. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。
2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头， 下同）。
3. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡 1分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
4. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用
5. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、样品 DNA 的制备
7. 如果有 N 个样品，最好设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 阳性对照的 10000 倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为 PC。另外用水作为 NC。
8. 用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数 DNA 提取试剂盒兼容。本试剂盒免费赠送 20 次免 DNA 提取的核酸释放剂，本产品的裂解液可以直接作为 PCR 模板，省略了 DNA 提取步骤。其使用手册可向本公司客服索取。
三、Probe qPCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），6 个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），1 个用于 PCR 阳性对照（用第 4 号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
10. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设 置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：
| 成分 | 样品管 N+2 个 |
PCR 阴性 对照管 |
标准曲线样品管（2-7 管） |
| 2×Probe qPCR MagicMix | 10 μL | 10 μL | 各 10 μL |
| 刚地弓形虫 qPCR 探针 | 1 μL | 1 μL | 各 2 μL |
| 刚地弓形虫探针法 qPCR 引物混合液 | 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
| N+2 个待测 DNA 模板 | 6 μL | - | - |
| 超纯水 | - | 6 μL | - |
| 第 7 步所得标准曲线样品稀释液（2-7 号） | - |
- |
各 6μL（2 号样到 2 号管，3 号 样到 3 号管…） |
11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR：
| 过程 | 温度 | 时间 |
| 预变性 | 95℃ | 5 min |
| PCR 反应 （40 个循环） |
95℃ | 15sec |
| 60℃ | 60sec（采集 FAM 通道的荧光 信号） |
四、数据处理
12. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 RNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。
13. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大于或等于 40 则为阴性，如果小于 40，则为阳性。
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实时荧光定量PCR从1996年美国AppliedBiosystems公司推出实时荧光定量PCR技术以来，该技术已经越来越广泛的应用到各类RNA的研究中，成为研究RNA必不可少的实验手段之一。目前比较常用的方法有两种：（1）TaqMan荧光探针法：该方法在特异性探针的两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。当探针完整时，荧光基团发光被淬灭基团吸收；在PCR扩增过程中，探针被降解，荧光基团与淬灭基团分离，发出可被检测到的荧光，以此来监测整个PCR过程。（2）SYBR荧光染料法：该方法
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