肠道病毒EV71 型(EV-71)核酸检测试剂盒(RT-PC

 

【产品名称】

通用名称：肠道病毒 EV71 型(EV-71)核酸检测试剂盒(RT-PCR 法)

Name ：Diagnostic Kit for Enterovirus type 71 RNA

【包装规格】48T/盒
 

【预期用途】

本试剂盒适用于检测粪便或腹泻物等标本中的肠道病毒 EV71 型 RNA，适用于肠道病毒 EV71 型感染的辅助诊断及流行病学调查，其检测结果仅供参考。

【检验原理】

本试剂盒用一对肠道病毒 EV71 型特异性引物，用 RT-PCR 技术对 EV-71 RNA 进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。

【试剂组成】

名         称	规          格
逆转录酶	50μL×1 管
EV-71 反应液	1mL×1 管
EV-71 阳性质控品	50μL ×1 管
阴性质控品	250μL ×1 管

说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用。

【储存条件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融少于 7 次，有效期 12 个月。
 

【所需仪器】

PCR 仪、电泳仪、紫外凝胶成像仪等
 

【标本采集】

取粪便或腹泻物置入无菌玻璃管中，用无菌棉球将试管塞紧后，密闭送检。

【保存和运输】

上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过 6 个月，标本运送应采用 2~8℃冰袋运输，严禁反复冻融。
 

【使用方法】

1. 样品处理（样本处理区）
   1. 样本前处理

取适量黄豆颗粒大小粪便或水样腹物置于 1.5mL 离心管中，按 RNA 提取试剂盒说明书进行提取
 

1. 2. RNA 提取

采用优利科（上海）生命科学有限公司生产的 RNA 提取试剂盒（离心柱提取法），请按照试剂盒说明书进行操作。
 

2. 试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为N（N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照），每测试反应体系配制如下表：

试剂	EV-71 反应液	逆转录酶
用量	20μL	1μL

 

3. 加样（样本处理区）

将步骤 1 提取的 RNA、阳性质控品、阴性质控品各取 4μL，加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。
 

4. PCR 扩增（核酸扩增区）
   1. 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；
   2. 推荐循环参数设置：

步骤	循环数	温度	时间
1	1 cycle	42℃	20min
2	1 cycle	94℃	2min
3	35 cycle	94℃	30sec
		58℃	30sec
		72℃	30sec

反应体系为 25μL；
 

5. 电泳检测

1. 2%琼脂糖凝胶配制：稀释 50×TAE 缓冲液至 1×TAE 缓冲液(取 20mL 50×TAE 缓冲液，加 980mL 双蒸水至 1L)，称 4g 琼脂糖放于 500mL 锥形瓶中，1×TAE 缓冲液 200 mL，置入微波炉中加热熔解(避免加热沸腾溶液外溢)，再加入 10μL 染料充分混匀。在电泳槽内放好梳子，倒入琼脂糖凝胶，待凝固后使用；
2. 电泳：在电泳槽中加入 1×TAE 缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。用移液器取 10μL PCR 扩增产物于琼脂糖凝胶孔中。加样后，以 5V/cm 电压，电泳 20-30min

（每次电泳时，每隔 10min 观察一次。当加样缓冲液中溴酚蓝电泳过半至凝胶下 2/5 处时，可停止电泳）。电泳后，紫外灯下观察结果。
 

6. 结果判定

EV-71 阳性质控品出现 120 bp 条带，阴性质控品不出现条带或出现片段较小的引物二聚体条带，实验结果成立。若被检样品出现 120 bp 条带，判断为阳性， 否则为阴性。
 

7. 产品性能指标

试剂灵敏性 10-3 以上，特异性 100%，批间批内差异≤3%。


 

注意事项】

• 所有操作严格按照说明书进行；
• 试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；
• 反应液应避光保存；
• 反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；
• 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；
• 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；
• 实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；
• 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全   通则》进行处理。