非洲猪瘟(ASFV)核酸检测试剂盒(荧光-PCR 法)

通用名称：非洲猪瘟(ASFV)核酸检测试剂盒(荧光-PCR 法)
Name ：African Swine Fever Virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包装规格】48T/盒

【预期用途】

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒（African Swine Fever Virus, ASFV）感染引起的猪急性、热性、高度接触性传染病。其特征为高热，网状内皮系统出血，死亡率高。家养猪和野猪都可以被感染，而且不分品种和年龄。ASFV 是非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属的唯一成员，钝缘蜱属的软蜱是 ASFV 的储存库和传播载体[1]。
本试剂盒适用于检测分泌物、血液、脾脏、扁桃体、肾脏和淋巴结等样本中的非洲猪瘟，用于非洲猪瘟感染的辅助诊断。

【检验原理】

本试剂盒根据非洲猪瘟基因组设计特异性引物和探针，用荧光 PCR 技术对非洲猪瘟的核酸进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。

【试剂组成】

名          称	规         格
核酸提取液	1.5mL×2 管
酶液	50μL×1 管
ASFV 反应液	1.0mL×1 管
ASFV 阳性质控品	50μL×1 管
阴性质控品	250μL×1 管

注：

1. 不同批号试剂不能混用。
2. 试剂盒内各试剂组份足够包装规格所标示的检测次数。

【储存条件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融少于 7 次，有效期 12 个月。

【适用仪器】

ABI 、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。

【标本采集】

病死或扑杀猪，取分泌物、血液、脾脏、扁桃体、肾脏和淋巴结等

【保存和运输】

上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过 6 个月，标本运送应采用 2~8℃冰袋运输，严禁反复冻融。

【使用方法】

1. 样品处理（样本处理区）
   1. 样本前处理

组织样品：每份组织分别从 3 个不同的位置称取样品约 1g，手术剪剪碎混匀后取
0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中，8000rpm 离心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中；全血样本：待血凝固后，取血清 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中。

1. 2. DNA 提取
      1. 对上述处理好的标本加入 50μL 核酸提取液，100℃恒温处理 10min，13,000

rpm 离心 5min，取上清液转移至新的 1.5mL EP 管，-20℃保存；

1. 1. 2. DNA 的提取也可以采用优利科（上海）生命科学有限公司生产的 DNA 提取试剂盒

（离心柱提取法），请严格按照试剂盒说明书进行操作。

2. 试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；样品每满 7 份，多配制 1 份)，每测试反应体系配制如下表：

试剂	ASFV 反应液	酶液
用量（样本数为 N）	20μL	1μL

将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，21uL/管。

3. 加样（样本处理区）

将步骤 1 提取的 DNA、阳性质控品、阴性质控品各取 4μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。

4. PCR 扩增（核酸扩增区）
   1. 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；
   2. 设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；

荧光通道选择： 检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）
NONE，ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光，选择 None 即可。

1. 3. 推荐循环参数设置：

步骤	循环数	温度	时间	收集荧光信号
1	1 cycle	95℃	10min	否
2	40 cycles	94℃	15sec	否
		55℃	30sec	是

5. 结果分析判定
   1. 结果分析条件设定

设置 Baseline 和 Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、stop 值(一般可在 5~20 范围内调节)，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。

1. 2. 结果判断

阳性：检测通道 Ct 值≤35.0，且曲线有明显的指数增长曲线。
可疑：检测通道 Ct 值>35.0，且出现明显扩增曲线的样本建议重复试验，重复试验结果出现 Ct 值≤35.0 和明显扩增曲线者为阳性，否则为阴性。
阴性：样本检测结果无 Ct 值且无明显的扩增曲线。

6. 检测方法的局限性

• 样本检测结果不样本收集、处理、运送以及保存质量有关；
• 样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；
• 阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；
• 病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；
• 不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；
• 试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；
• 本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

7. 质控标准

阴性质控品：无明显扩增曲线或无 Ct 值显示；
阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且 Ct 值≤32； 以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

【注意事项】

• 所有操作严格按照说明书进行；
• 试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀幵短暂离心；
• 反应液应避光保存；
• 反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；
• 使用一次性吸头、一次性手套和各区与用工作服；
• 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；
• 实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；
• 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，幵按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

【参考文献】

1. 国家质量监督检验检疫总局. SN/T 1559-2010 非洲猪瘟检疫技术规范[S].
2. 黄萍, 肖家勇, 欧阳振宇. 非洲猪瘟病毒实时荧光定量 PCR 检测方法的建立[S]. 中国动物检疫, 2010.
3. 董志珍, 侯艳梅, 赵祥平. 非洲猪瘟病毒实时荧光定量 PCR 检测方法的建立[S]. 中国兽医杂志, 2009.