丙二醛MDA试剂盒

 
丙二醛MDA试剂盒



微量法
注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：
氧自由基作用于脂质的不饱和脂肪酸，生成过氧化脂质；后者逐渐分解为一系列复杂的化合物，其中包括MDA。通过检测MDA的水平即可检测脂质氧化的水平。

测定原理：
MDA与硫代巴bi妥酸(thiobarbituric acid，TBA)缩合，生成红色产物，在532nm有大吸收峰，进行比色后可估测样品中过氧化脂质的含量；同时测定600nm下的吸光度，利用532nm与600nm下的吸光度的差值计算MDA的含量。 

需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配置：
提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存；
试剂一：液体30mL×1瓶，4℃保存；
注意事项：
临用前注意试剂一是否完全溶解，如未溶解，可以70℃-90℃加热，并振荡以促进溶解。

MDA提取： 
1、细菌、细胞或组织样品的制备：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、血清（浆）样品：直接检测。



测定步骤：
1、吸取0.3mL 试剂一于1.5mL离心管中，再加入0.1mL样本, 混匀。
2、95℃水浴中保温30min（盖紧，防止水分散失），置于冰浴中冷却，10000g，25℃，离心10min。
3、吸取200μL上清液于微量石英比色皿或96孔板中，测定532nm和600nm处的吸光度，记为A532和A600，ΔA= A532-A600。

MDA含量计算：
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1、血清（浆）中MDA含量的计算：
MDA含量(nmol/ mL)=[ ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷V样=25.8×ΔA 
2、细菌、细胞或动物组织中MDA含量计算
（1）按照蛋白浓度计算
MDA含量(nmol/ mg prot)=[ ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V样)=25.8× ΔA ÷Cpr
需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒。
（2）按照样品质量计算
MDA含量(nmol/g 鲜重)=[ ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V样÷V样总)=25.8×ΔA ÷W
 (3 ) 按照细菌或细胞密度计算：
MDA含量(nmol/104)=[ ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)=0.0516×ΔA
V反总：反应体系总体积， 4×10-4 L；ε：丙二醛摩尔消光系数，155×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.1 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。
b.用96孔板测定的计算公式如下
1、血清（浆）中MDA含量的计算：
MDA含量(nmol/ mL)=[ ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷V样=51.6×ΔA 
2、细菌、细胞或动物组织中MDA含量计算
（1）按照蛋白浓度计算
MDA含量(nmol/ mg prot)=[ ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V样)=51.6×ΔA÷Cpr
需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒。
（2）按照样品质量计算
MDA含量(nmol/g 鲜重)=[ ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V样÷V样总)=51.6×ΔA÷W
 (3 ) 按照细菌或细胞密度计算：
MDA含量(nmol/104)=[ ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)=0.1032×ΔA
V反总：反应体系总体积，4×10-4 L；ε：丙二醛摩尔消光系数，155×103 L / mol /cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.1 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。