丙tong酸脱羧酶pyruvate decarboxylas

丙tong酸脱羧酶pyruvate decarboxylase,PDC活性测定试剂盒
分光光度法 
注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：
PDC主要存在于酵母中，是乙醇发酵的关键酶之一，催化丙tong酸脱羧生成乙醛。

测定原理：
PDC催化丙tong酸脱羧生成乙醛，添加乙醇脱氢酶（ADH）来进一步催化 NADH还原乙醛生成乙醇和NAD+；NADH在340 nm有吸收峰，而NAD+没有；通过测定340 nm光吸收下降速率，来计算PDC活性。

自备仪器和用品：
研钵、冰、台式离心机、紫外分光光度计、1mL石英比色皿、可调式移液枪和蒸馏水。



试剂组成和配制：
试剂一：液体50mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：液体36mL×1瓶，4℃保存。
试剂三：液体5mL×1瓶，4℃保存。
试剂四：粉剂×1支，﹣20℃保存。
试剂五：液体60μL×1支，﹣20℃保存。
混合试剂：临用前配制，将试剂四和试剂五转移至试剂三中充分溶解待用，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
试剂六：液体5mL×1瓶，4℃保存。

粗酶液提取：
1、细菌或细胞处理：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每200万细菌或细胞加入400μL试剂一，超声波破碎细菌或细胞（功率200W，工作3s，间歇10s，工作35次），16000g 4℃离心20min，取上清，置冰上待测。
2、组织处理：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆，16000g 4℃离心20min，取上清，置冰上待测。
3、血清（浆）等液体样品：直接检测。

PDC测定操作：
1. 分光光度计预热30min，调节波长到340 nm，蒸馏水调零。
2. 试剂二置于25℃水浴中预热30 min。
3. 空白管：依次在1mL石英比色皿中加入100μL蒸馏水、100μL混合试剂、700μL试剂二和100μL试剂六，迅速混匀后于340nm比色，记录15s和75s的吸光值，分别记为A1和A2。
4. 测定管：依次在1mL石英比色皿中加入100μL上清液、100μL混合试剂、700μL试剂二和100μL试剂六，迅速混匀后于340nm比色，记录15s和75s的吸光值，分别记为A3和A4。
注意：空白管只需测定一次。

丙tong酸脱羧酶pyruvate decarboxylase,PDC活性测定试剂盒
PDC活性计算公式：
（1）按照蛋白浓度计算
活性单位定义：25℃中，每毫克蛋白每分钟催化1nmol NADH 氧化为1个酶活单位。
PDC (nmol/min/mg prot) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V总×109}÷(Cpr×V样) ÷T=1608×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷Cpr
（2）按照样本质量计算
活性单位定义：25℃中，每克组织每分钟催化1nmol NADH 氧化为1个酶活单位。
PDC (nmol/min /g鲜重) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V总×109}÷(W×V样÷V样总) ÷T=1608×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷W
（3）按细胞数量计算
活性单位定义：25℃中，每104个细胞每分钟催化1nmol NADH 氧化为1个酶活单位。
PDC (nmol/min/104cell) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V总×109}÷(细胞数量×V样÷V样总) ÷T=1608×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷细胞数量
（4）按血清（浆）体积计算
活性单位定义：25℃中，每毫升血清（浆）每分钟催化1nmol NADH 氧化为1个酶活单位。PDC (nmol/min /mL) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V总×109}÷V样÷T=1608×[(A3－A4)－(A1-A2)]
ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V总：反应体系总体积，1mL=0.001 L，V样：加入反应体系中上清液体积，0.1mL；Cpr：蛋白浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量试剂盒；W：样本质量，g ；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，1 min。