蔗糖磷酸合成酶Sucrose phosphate synth

蔗糖磷酸合成酶Sucrose phosphate synthase，SPS试剂盒
分光光度法 
注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：
蔗糖不仅是重要的光合产物，也是植物体内运输的主要物质，还是碳水化合物的贮存形式之一。SPS（EC 2.4.1.14）以果糖-6-磷酸为受体，形成的蔗糖磷酸在蔗糖磷酸酶的作用下形成蔗糖。一般把蔗糖磷酸酯合成酶-蔗糖磷酸酶系统看作是蔗糖合成的主要途径。

测定原理：
蔗糖磷酸合成酶催化果糖-6-磷酸形成蔗糖磷酸，蔗糖磷酸与间苯二酚反应可呈现颜色变化，在480nm下有特征吸收峰，酶活力大小与颜色的深浅成正比。

需自备的的仪器和用品：
可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水



试剂的组成和配制：
提取液：液体60mL×1瓶，4℃保存；
试剂一：液体4mL×1瓶，-20℃保存；
试剂二：1000μg/mL蔗糖溶液10mL×1瓶，4℃保存；
试剂三：液体3mL×1瓶，4℃保存；
试剂四：液体40mL×1瓶，4℃保存；
试剂五：液体12mL×1瓶，4℃避光保存；

样品测定的准备： 
按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：

试剂名称（μL）	测定管	对照管	标准管	空白管
样本	30	30
蒸馏水		150	150	180
试剂二			30
试剂一	150

混匀，25℃准确水浴10min

试剂三

50

50

50

50

沸水浴中煮沸10min左右（盖紧，以防止水分散失），冷却

试剂四	700	700	700	700
试剂五	200	200	200	200

混匀，沸水浴30min，冷却后， 480nm下测定各管吸光值。标准管和空白管只要做一管。每个测定管需要设一个对照管。

蔗糖磷酸合成酶Sucrose phosphate synthase，SPS试剂盒
SPS活力单位的计算：
1、按照蛋白浓度计算
单位定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1μg 蔗糖定义为一个酶活力单位。
SPS活性(μg /min/mg prot)= C标准管×V1×（A测定管-A对照管)÷（A标准管-A空白管)÷(V1×Cpr)÷T=100×（A测定管-A对照管)÷（A标准管-A空白管)÷Cpr
2、按照样本鲜重计算
单位定义：每g组织每分钟催化产生1μg 蔗糖定义为一个酶活力单位。
SPS活性(μg /min /g鲜重) =  C标准管×V1×（A测定管-A对照管)÷（A标准管-A空白管)÷(W×V1÷V2)÷T=100×（A测定管-A对照管)÷（A标准管-A空白管)÷W 
C标准管：标准管浓度，1000μg/mL；V1：加入反应体系中样本体积，0.03mL； V2：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g；T ：反应时间：10min。