己糖激酶hexokinase，HK试剂盒

己糖激酶hexokinase，HK试剂盒
分光光度法 
注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：
HK（EC 2.7.1.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是葡萄糖分解过程中的个关键酶，催化葡萄糖转化为6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖是糖酵解和磷酸戊糖途径的交叉点。

测定原理：
HK催化葡萄糖合成6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步催化6-磷酸葡萄糖脱氢生成NADPH，NADPH在340nm有特征吸收峰。

需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。



试剂的组成和配制：
提取液：60mL×1瓶，4℃保存； 
试剂一：液体30mL×1瓶， 4℃保存；
试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入30mL蒸馏水充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
试剂三：液体5 mL×1瓶，4℃保存；
试剂四：粉剂×1支，-20℃保存，临用前加入4mL蒸馏水充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
试剂五：粉剂×1支，-20℃保存；临用前加入2mL蒸馏水充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
试剂六：粉剂×1支，-20℃保存；临用前加入250μL试剂一和250μL蒸馏水充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

样本的前处理：
1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
3、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：
1、分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
2、将试剂一、二、三、四和五37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)预热10分钟。
3、加样表：

试剂名称（μL）	测定管
试剂一	400
试剂二	400
试剂三	80
试剂四	80
试剂五	40
试剂六	8
样本	30

将上述试剂按顺序加入1 mL石英比色皿中，立即混匀，加样本的同时开始计时，在340 nm波长下记录20秒时的初始吸光度A1和5分20秒时的吸光度A2，计算ΔA=A2-A1。

注意事项：
1、为了减小操作误差，建议将试剂一、二、三、四、五按比例配成混合液，预热10min，取30μL样本+8μL试剂六+1mL混合液，混匀后按照上述步骤检测。
2、不同匀浆组织中HK活力不一样，做正式试验之前请做1-2只预试，若ΔA>0.5，则说明组织活力太高，必须用提取液稀释成适当浓度匀浆上清液（计算公式中乘以相应稀释倍数），或缩短反应时间至2min,使ΔA<0.5，以提高检测灵敏度。

己糖激酶hexokinase，HK试剂盒
HK活性计算：
1、血清（浆）HK活性
单位的定义：每毫升血清（浆）在每分钟生成1 nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。
HK（nmol/min/mL）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷V样÷T=1113×ΔA
2、组织、细菌或细胞中HK活性
（1）按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1 nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。
HK（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=1113×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算
单位的定义：每g组织每分钟生成1 nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。
HK（nmol/min /g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W ×V样÷V样总) ÷T=1113×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。
HK（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T=2.226×ΔA
V反总：反应体系总体积，1.038×10-3 L；ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.03 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。