谷氨酰胺酶glutaminase, GLS活性测定试剂盒

谷氨酰胺酶glutaminase, GLS活性测定试剂盒
分光光度法 
注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：
GLS（EC 3.5.1.1）是酰胺基水解酶，催化天冬酰胺水解成谷氨酸和氨，在氮素代谢中具有重要调控作用，尤其是调节游离氨含量和尿素代谢。

测定原理：
GLS催化谷氨酰胺水解成L-谷氨酸和氨，利用奈氏试剂检测氨增加的速率，即可计算其酶活性。
需自备仪器和用品：
台式离心机、可见分光光度计、水浴锅、1mL玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制：
试剂一×1瓶，60 mL，4 ℃保存；
试剂二×1瓶，20 mL，4 ℃保存；
试剂三×1瓶，30 mL，常温保存；
试剂四×1瓶，10 mL，常温保存；
试剂五×1瓶，6 mL，常温保存；
试剂六×1瓶，6 mL，常温避光保存。



粗酶液提取：
1、细菌、细胞或组织样品的制备：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量
（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL试剂一），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；
8000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，
加入1mL试剂一），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：
1、分光光度计预热30min以上，调节波长至420nm，蒸馏水调零。
2、样品测定（在EP中加入下列试剂）：

混匀，8000 g，25℃离心10 min；取上清液，在EP管中加入下列试剂

上清液	650	650
试剂四	150	150
试剂五	100	100
试剂六	100	100

混匀，室温静置15min，420nm处读取吸光值A，计算ΔA=A测定管-A对照管。对照管只要做一管。

注意：
1、试剂六如出现沉淀，静置后取上清使用。
2、ΔA（A测定管-A对照管）若出现负值，可能是酶活性较低，可将反应时间1h延长到2h，相应的在计算公式中除以2。

谷氨酰胺酶glutaminase, GLS活性测定试剂盒
酶活性计算：
标准条件下测定的回归方程为y =3.8488x +0.0057，R2 = 0.9983；；x为标准品浓度（μmol/mL），y为吸光值A。
1、血清（浆）GLS活性
单位定义：每mL血清（浆）每min催化谷氨酰胺生成1nmol 氨定义为一个酶活力单位。GLS（nmol /min /mL）＝ (ΔA-0.0057) ÷3.8488×V反总÷V样÷T×1000=181.8×(ΔA -0.0057)
 2、组织、细菌或细胞GLS活性
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位定义：每mg蛋白质每min催化谷氨酰胺生成1nmol 氨定义为一个酶活力单位。
GLS（nmol /min /mg prot）＝ (ΔA-0.0057) ÷3.8488×V反总÷(V样×Cpr)÷T×1000=181.8×(ΔA -0.0057)÷Cpr
（2）按样本鲜重计算：
单位定义：每g组织每min催化谷氨酰胺生成1nmol 氨定义为一个酶活力单位。
GLS（nmol/min/g 鲜重）＝(ΔA-0.0057)÷3.8488×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T×1000
=181.8×(ΔA -0.0057)÷W
（3）按细菌或细胞密度计算
单位定义：每1万个细菌或细胞每min催化谷氨酰胺生成1nmol 氨定义为一个酶活力单位。GLS（nmol/min/104 cell）＝(ΔA-0.0057) ÷3.8488×V反总÷(500× V样÷V样总)÷T×1000
=0.3637×(ΔA-0.0057)
V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，60min；V反总：反应体系总体积，1.05mL；V样：加入反应体系中样本体积，0.025mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万; 1000，μmol到nmol换算系数。