pNZ8148乳酸菌分泌质粒

基本信息
名称：pNZ8148乳酸菌分泌质粒
别称: pNZ8148

启动子:	PnisA
复制子:	repA
终止子:	T
质粒分类:	乳酸乳球菌表达载体
质粒大小:	3167bp
原核抗性:	Chl
筛选标记:	Chl
克隆菌株:	MC1061
培养条件:	37度
表达宿主:	NZ9000乳酸乳球菌
培养条件:	M17+0.5%葡萄糖/30度密封静置液体培养
5'测序引物:	根据序列设计

质粒属性

载体宿主：	乳酸菌
载体用途：	蛋白表达
基因种属：	空载体
基因类型：	ORF
原核抗性：	Chl
筛选标记：
荧光蛋白：

质粒简介
  The pNZ8148 vector contains an origin of replication (ORI), the gene for the resistance to chloramphenicol, two genes for the replication proteins repA and repC, the nisin-inducible promoter (P nisA), and the transcription terminator (T). The gene, tagged with a Strep-tag II (STREP) followed by a stop codon (*), can be inserted between the necessary NcoI site and another endonuclease site from the multicloning site (MCS) such as PstI, SphI, KpnI, SpeI, XbaI, SacI and HindIII. The replicons of the vectors pNZ8008, pNZ8148, pNZ8149 and pNZ8150 are identical and came originally from the Lactococcus lactis plasmid pSH71. However, this replicon has a broad host range. Plasmids with this replicon can replicate in many Gram-positive bacteria, such as Lactobacillus plantarum and Streptococcus thermophilus. pNZ8148 – In this vector the nisA promoter is followed by an NcoI site for translational fusions at the ATG. It contains a terminator after the MCS. Sequence adaptation for cloning in NcoI can result in a change in the second amino acid of a protein (Mierau and Kleerebezem, 2005).
质粒图谱


质粒序列
LOCUS       Exported                3167 bp ds-DNA     circular SYN 29-AUG-2016
FEATURES             Location/Qualifiers
     source          1..3167
                     /organism="synthetic DNA construct"
                     /mol_type="other DNA"
     misc_feature    5..188
                     /note="Pnis"
     misc_feature    393..445
                     /note="Terminator"
     misc_feature    787..996
                     /note="repC"
     misc_feature    1264..1962
                     /note="repA"
     misc_feature    2421..3071
                     /note="Cm"
ORIGIN
        1 agatctagtc ttataactat actgacaata gaaacattaa caaatctaaa acagtcttaa
       61 ttctatcttg agaaagtatt ggtaataata ttattgtcga taacgcgagc ataataaacg
      121 gctctgatta aattctgaag tttgttagat acaatgattt cgttcgaagg aactacaaaa
      181 taaattataa ggaggcactc accatgggta ctgcaggcat gcggtaccac tagttctaga
      241 gagctcaagc tttctttgaa ccaaaattag aaaaccaagg cttgaaacgt tcaattgaaa
      301 tggcaattaa acaaattaca gcacgtgttg ctttgattga tagccaaaaa gcagcagttg
      361 ataaagcaat tactgatatt gctgaaaaat tgtaatttat aaataaaaat caccttttag
      421 aggtggtttt tttatttata aattattcgt ttgatttcgc tttcgataga acaatcaaat
      481 cgtttctgag acgttttagc gtttatttcg tttagttatc ggcataatcg ttaaaacagg
      541 cgttatcgta gcgtaaaagc ccttgagcgt agcgtggctt tgcagcgaag atgttgtctg
      601 ttagattatg aaagccgatg actgaatgaa ataataagcg cagcgtcctt ctatttcggt
      661 tggaggaggc tcaagggagt ttgagggaat gaaattccct catgggtttg attttaaaaa
      721 ttgcttgcaa ttttgccgag cggtagcgct ggaaaatttt tgaaaaaaat ttggaatttg
      781 gaaaaaaatg gggggaaagg aagcgaattt tgcttccgta ctacgacccc ccattaagtg
      841 ccgagtgcca atttttgtgc caaaaacgct ctatcccaac tggctcaagg gtttgagggg
      901 tttttcaatc gccaacgaat cgccaacgtt ttcgccaacg ttttttataa atctatattt
      961 aagtagcttt atttttgttt ttatgattac aaagtgatac actaatttta taaaattatt
     1021 tgattggagt tttttaaatg gtgatttcag aatcgaaaaa aagagttatg atttctctga
     1081 caaaagagca agataaaaaa ttaacagata tggcgaaaca aaaagatttt tcaaaatctg
     1141 cggttgcggc gttagctata gaagaatatg caagaaagga atcagaacaa aaaaaataag
     1201 cgaaagctcg cgtttttaga aggatacgag ttttcgctac ttgtttttga taaggtaatt
     1261 atatcatggc tattaaaaat actaaagcta gaaattttgg atttttatta tatcctgact
     1321 caattcctaa tgattggaaa gaaaaattag agagtttggg cgtatctatg gctgtcagtc
     1381 ctttacacga tatggacgaa aaaaaagata aagatacatg gaatagtagt gatgttatac
     1441 gaaatggaaa gcactataaa aaaccacact atcacgttat atatattgca cgaaatcctg
     1501 taacaataga aagcgttagg aacaagatta agcgaaaatt ggggaatagt tcagttgctc
     1561 atgttgagat acttgattat atcaaaggtt catatgaata tttgactcat gaatcaaagg
     1621 acgctattgc taagaataaa catatatacg acaaaaaaga tattttgaac attaatgatt
     1681 ttgatattga ccgctatata acacttgatg aaagccaaaa aagagaattg aagaatttac
     1741 ttttagatat agtggatgac tataatttgg taaatacaaa agatttaatg gcttttattc
     1801 gccttagggg agcggagttt ggaattttaa atacgaatga tgtaaaagat attgtttcaa
     1861 caaactctag cgcctttaga ttatggtttg agggcaatta tcagtgtgga tatagagcaa
     1921 gttatgcaaa ggttcttgat gctgaaacgg gggaaataaa atgacaaaca aagaaaaaga
     1981 gttatttgct gaaaatgagg aattaaaaaa agaaattaag gacttaaaag agcgtattga
     2041 aagatacaga gaaatggaag ttgaattaag tacaacaata gatttattga gaggagggat
     2101 tattgaataa ataaaagccc ccctgacgaa agtcgacggc aatagttacc cttattatca
     2161 agataagaaa gaaaaggatt tttcgctacg ctcaaatcct ttaaaaaaac acaaaagacc
     2221 acatttttta atgtggtctt ttattcttca actaaagcac ccattagttc aacaaacgaa
     2281 aattggataa agtgggatat ttttaaaata tatatttatg ttacagtaat attgactttt
     2341 aaaaaaggat tgattctaat gaagaaagca gacaagtaag cctcctaaat tcactttaga
     2401 taaaaattta ggaggcatat caaatgaact ttaataaaat tgatttagac aattggaaga
     2461 gaaaagagat atttaatcat tatttgaacc aacaaacgac ttttagtata accacagaaa
     2521 ttgatattag tgttttatac cgaaacataa aacaagaagg atataaattt taccctgcat
     2581 ttattttctt agtgacaagg gtgataaact caaatacagc ttttagaact ggttacaata
     2641 gcgacggaga gttaggttat tgggataagt tagagccact ttatacaatt tttgatggtg
     2701 tatctaaaac attctctggt atttggactc ctgtaaagaa tgacttcaaa gagttttatg
     2761 atttatacct ttctgatgta gagaaatata atggttcggg gaaattgttt cccaaaacac
     2821 ctatacctga aaatgctttt tctctttcta ttattccttg gacttcattt actgggttta
     2881 acttaaatat caataataat agtaattacc ttctacccat tattacagca ggaaaattca
     2941 ttaataaagg taattcaata tatttaccgc tatctttaca ggtacatcat tctgtttgtg
     3001 atggttatca tgctggattg tttatgaact ctattcagga attgtcagat aggcctaatg
     3061 actggctttt ataatatgag ataatgccga ctgtactttt tacagtcggt tttctaatgt
     3121 cactaacctg ccccgttagt tgaagaaggt ttttatatta cagctcc
//

质粒菌株产品操作说明书
一、扩增流程
         收到产品后，请先根据产品管壁标签来判断产品形式，并在扩增前准确查找该质粒菌株的抗性、感受态和培养温度。
         1、质粒干粉（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
              ①收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min，再加入20μl ddH2O去离子水溶解质粒；
              ②取1支100μl 感受态于冰上解冻10min，加入2μl质粒，再冰浴30min后，42℃热激60s，不要搅动，再冰浴2min；（从第二步开始均要在超净工作台中无菌操作）
              ③加入900μl无抗的LB液体培养基，180rpm震荡37℃培养45min；
              ④6000rpm离心5min，仅留100μl上清液重悬细菌沉淀，并涂布至目标质粒抗性的LB平板上；（可使用本平台的平板涂布专用玻璃珠进行涂布，可以比传统涂布方法获得更多转化子）
              ⑤将平板正向培养1h，再倒置37℃培养14h。如果要求是30度则培养20h；
（菌落过多则将质粒稀释后再转化。没有菌落则加入10μl质粒转化。另不要直接转表达感受态，要先转克隆感受态，重提质粒后再导入表达感受态）
              ⑥挑取单菌落至LB液体培养基中，加入对应抗生素，220rpm震荡培养14h，根据实验需要和质粒提取试剂盒说明书提取质粒。
        2、甘油菌种（冰袋运输，存于-80℃，保质期90天，请务必划线挑单克隆培养）
              四区划线后挑单菌落培养，酵母菌需要先液体复苏再四区划线，再挑单菌落液体培养。
        3、穿刺菌种（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）
              穿刺接种，液体培养后四区划线，再挑单菌落液体培养。
        4、菌落平板（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）
              直接挑取单菌落至液体培养基中。
        5、液体质粒（冰袋运输，存于-20℃，保质期90天）
              单独提取的液体质粒收到后可直接使用。
        6、滤纸质粒（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
              收到货后将滤纸画圈部分剪下放入EP管中，加100ul无菌水将滤纸浸湿并浸泡5min，吸取5ul质粒转化，离心全涂。

二、转化图片

P3698/pCMV-SPORT6-TUBA1B人源基因质粒

P3699/pCMV-SPORT6-METTL18人源基因质粒

P3700/pCMV-SPORT6-RSRC2人源基因质粒

P3701/pCMV-SPORT6-GAPDH人源基因质粒

P3702/pCMV-SPORT6-BRF2人源基因质粒

P3703/pCMV-SPORT6-PIK3IP1（3点突变 )人源基因质粒

P3704/pCMV-SPORT6-TMEM59L（1同义突变）人源基因质粒

P3705/pCMV-SPORT6-ARMT1人源基因质粒

P3706/pCMV-SPORT6-TFAP4人源基因质粒

P3707/pCMV-SPORT6-RIOX1（2点突变1同义突变）人源基因质粒