pCMV-Tag 4B哺乳表达质粒

基本信息
名称：pCMV-Tag 4B哺乳表达质粒
别称: pCMV-Tag 4B

启动子:	CMV
复制子:	pUC
终止子:	SV40 poly（A） signal
质粒分类:	哺乳细胞载体;蛋白过表达质粒
质粒大小:	4320bp
质粒标签:	C-FLAG tag
原核抗性:	Kan
筛选标记:	G418
克隆菌株:	DH5a
培养条件:	37度
表达宿主:	哺乳细胞
培养条件:	37℃，有氧，LB
诱导方式:	无需诱导，瞬时表达
5'测序引物:	CMV-F : CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG
3'测序引物:	根据序列设计
备注:	pCMV-Tag 4 A,B,C的差别仅在于读码框（阅读框）处。

质粒属性

载体宿主：	哺乳细胞
载体用途：	蛋白表达
基因种属：	空载体
基因类型：	ORF
原核抗性：	Kan
真核抗性：	Neo/G418
荧光蛋白：

质粒简介


质粒图谱


质粒序列
LOCUS       Exported                4320 bp ds-DNA     circular SYN 28-十一月-2013
DEFINITION  Mammalian expression vector for tagging proteins with a C-terminal
            FLAG epitope. For other reading frames, use pCMV-Tag 4A or pCMV-Tag
            4C.
ACCESSION   .
VERSION     .
KEYWORDS    pCMV-Tag 4B
SOURCE      synthetic DNA construct
  ORGANISM  synthetic DNA construct
REFERENCE   1  (bases 1 to 4320)
  AUTHORS   Agilent Technologies
  TITLE     Direct Submission
  JOURNAL   Exported 2016年9月18日 from SnapGene Viewer 2.8.1
            http://www.miaolingbio.com
COMMENT     The cloned gene must include a Kozak sequence and start codon.
FEATURES             Location/Qualifiers
     source          1..4320
                     /organism="synthetic DNA construct"
                     /lab_host="Mammalian Cells"
                     /mol_type="other DNA"
     enhancer        66..370
                     /note="CMV enhancer"
                     /note="human cytomegalovirus immediate early enhancer"
     promoter        371..574
                     /note="CMV promoter"
                     /note="human cytomegalovirus (CMV) immediate early
                     promoter"
     promoter        620..638
                     /note="T3 promoter"
                     /note="promoter for bacteriophage T3 RNA polymerase"
     misc_feature    651..744
                     /note="MCS"
                     /note="multiple cloning site"
     CDS             745..768
                     /codon_start=1
                     /product="FLAG epitope tag, followed by an enterokinase
                     cleavage site"
                     /note="FLAG"
                     /translation="DYKDDDDK"
     misc_feature    784..794
                     /note="stop codons"
                     /note="stop codons in all three reading frames"
     promoter        complement(822..840)
                     /note="T7 promoter"
                     /note="promoter for bacteriophage T7 RNA polymerase"
     polyA_signal    1114..1235
                     /note="SV40 poly(A) signal"
                     /note="SV40 polyadenylation signal"
     rep_origin      complement(1242..1697)
                     /direction=LEFT
                     /note="f1 ori"
                     /note="f1 bacteriophage origin of replication; arrow
                     indicates direction of (+) strand synthesis"
     promoter        1724..1826
                     /gene="bla"
                     /note="AmpR promoter"
     promoter        1830..2187
                     /note="SV40 promoter"
                     /note="SV40 enhancer and early promoter"
     CDS             2222..3016
                     /codon_start=1
                     /gene="aph(3')-II (or nptII)"
                     /product="aminoglycoside phosphotransferase from Tn5"
                     /note="NeoR/KanR"
                     /note="confers resistance to neomycin, kanamycin, and G418
                     (Geneticin)"
                     /translation="MIEQDGLHAGSPAAWVERLFGYDWAQQTIGCSDAAVFRLSAQGRP
                     VLFVKTDLSGALNELQDEAARLSWLATTGVPCAAVLDVVTEAGRDWLLLGEVPGQDLLS
                     SHLAPAEKVSIMADAMRRLHTLDPAT-CPFDHQAKHRIERARTRMEAGLVDQDDLDEEHQ
                     GLAPAELFARLKASMPDGEDLVVTHGDACLPNIMVENGRFSGFIDCGRLGVADRYQDIA
                     LATRDIAEELGGEWADRFLVLYGIAAPDSQRIAFYRLLDEFF"
     misc_feature    3248..3295
                     /note="HSV TK poly(A) signal"
                     /note="herpesvirus thymidine kinase polyadenylation signal"
     rep_origin      3624..4212
                     /direction=RIGHT
                     /note="ori"
                     /note="high-copy-number ColE1/pMB1/pBR322/pUC origin of
                     replication"
ORIGIN
        1 atgcattagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc catatatgga
       61 gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg
      121 cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg
      181 acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca
      241 tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc
      301 ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc
      361 tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc
      421 acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa
      481 tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag
      541 gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctggttta gtgaaccgtc agatccgcta
      601 gcgattacgc caagctcgaa attaaccctc actaaaggga acaaaagctg gagctccacc
      661 gcggtggcgg ccgctctagc ccgggcggat cccccgggct gcaggaattc gatatcaagc
      721 ttatcgatac cgtcgacact cgaggattac aaggatgacg acgataagta gggcccggta
      781 ccttaattaa ttaaggtacc aggtaagtgt acccaattcg ccctatagtg agtcgtatta
      841 caattcactc gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg aatggcgaat ggagatccaa
      901 tttttaagtg tataatgtgt taaactactg attctaattg tttgtgtatt ttagattcac
      961 agtcccaagg ctcatttcag gcccctcagt cctcacagtc tgttcatgat cataatcagc
     1021 cataccacat ttgtagaggt tttacttgct ttaaaaaacc tcccacacct ccccctgaac
     1081 ctgaaacata aaatgaatgc aattgttgtt gttaacttgt ttattgcagc ttataatggt
     1141 tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag catttttttc actgcattct
     1201 agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta tcttaacgcg taaattgtaa gcgttaatat
     1261 tttgttaaaa ttcgcgttaa atttttgtta aatcagctca ttttttaacc aataggccga
     1321 aatcggcaaa atcccttata aatcaaaaga atagaccgag atagggttga gtgttgttcc
     1381 agtttggaac aagagtccac tattaaagaa cgtggactcc aacgtcaaag ggcgaaaaac
     1441 cgtctatcag ggcgatggcc cactacgtga accatcaccc taatcaagtt ttttggggtc
     1501 gaggtgccgt aaagcactaa atcggaaccc taaagggagc ccccgattta gagcttgacg
     1561 gggaaagccg gcgaacgtgg cgagaaagga agggaagaaa gcgaaaggag cgggcgctag
     1621 ggcgctggca agtgtagcgg tcacgctgcg cgtaaccacc acacccgccg cgcttaatgc
     1681 gccgctacag ggcgcgtcag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg
     1741 tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat
     1801 gcttcaataa tattgaaaaa ggaagaatcc tgaggcggaa agaaccagct gtggaatgtg
     1861 tgtcagttag ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg
     1921 catctcaatt agtcagcaac caggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt
     1981 atgcaaagca tgcatctcaa ttagtcagca accatagtcc cgcccctaac tccgcccatc
     2041 ccgcccctaa ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atggctgact aatttttttt
     2101 atttatgcag aggccgaggc cgcctcggcc tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc
     2161 ttttttggag gcctaggctt ttgcaaagat cgatcaagag acaggatgag gatcgtttcg
     2221 catgattgaa caagatggat tgcacgcagg ttctccggcc gcttgggtgg agaggctatt
     2281 cggctatgac tgggcacaac agacaatcgg ctgctctgat gccgccgtgt tccggctgtc
     2341 agcgcagggg cgcccggttc tttttgtcaa gaccgacctg tccggtgccc tgaatgaact
     2401 gcaagacgag gcagcgcggc tatcgtggct ggccacgacg ggcgttcctt gcgcagctgt
     2461 gctcgacgtt gtcactgaag cgggaaggga ctggctgcta ttgggcgaag tgccggggca
     2521 ggatctcctg tcatctcacc ttgctcctgc cgagaaagta tccatcatgg ctgatgcaat
     2581 gcggcggctg catacgcttg atccggctac ctgcccattc gaccaccaag cgaaacatcg
     2641 catcgagcga gcacgtactc ggatggaagc cggtcttgtc gatcaggatg atctggacga
     2701 agaacatcag gggctcgcgc cagccgaact gttcgccagg ctcaaggcga gcatgcccga
     2761 cggcgaggat ctcgtcgtga cccatggcga tgcctgcttg ccgaatatca tggtggaaaa
     2821 tggccgcttt tctggattca tcgactgtgg ccggctgggt gtggcggacc gctatcagga
     2881 catagcgttg gctacccgtg atattgctga agaacttggc ggcgaatggg ctgaccgctt
     2941 cctcgtgctt tacggtatcg ccgctcccga ttcgcagcgc atcgccttct atcgccttct
     3001 tgacgagttc ttctgagcgg gactctgggg ttcgaaatga ccgaccaagc gacgcccaac
     3061 ctgccatcac gagatttcga ttccaccgcc gccttctatg aaaggttggg cttcggaatc
     3121 gttttccggg acgccggctg gatgatcctc cagcgcgggg atctcatgct ggagttcttc
     3181 gcccacccta gggggaggct aactgaaaca cggaaggaga caataccgga aggaacccgc
     3241 gctatgacgg caataaaaag acagaataaa acgcacggtg ttgggtcgtt tgttcataaa
     3301 cgcggggttc ggtcccaggg ctggcactct gtcgataccc caccgagacc ccattggggc
     3361 caatacgccc gcgtttcttc cttttcccca ccccaccccc caagttcggg tgaaggccca
     3421 gggctcgcag ccaacgtcgg ggcggcaggc cctgccatag cctcaggtta ctcatatata
     3481 ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt
     3541 gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc
     3601 gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg
     3661 caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact
     3721 ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg
     3781 tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg
     3841 ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac
     3901 tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca
     3961 cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga
     4021 gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc
     4081 ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct
     4141 gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg
     4201 agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct
     4261 tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc
//

质粒菌株产品操作说明书
一、扩增流程
         收到产品后，请先根据产品管壁标签来判断产品形式，并在扩增前准确查找该质粒菌株的抗性、感受态和培养温度。
         1、质粒干粉（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
              ①收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min，再加入20μl ddH2O去离子水溶解质粒；
              ②取1支100μl 感受态于冰上解冻10min，加入2μl质粒，再冰浴30min后，42℃热激60s，不要搅动，再冰浴2min；（从第二步开始均要在超净工作台中无菌操作）
              ③加入900μl无抗的LB液体培养基，180rpm震荡37℃培养45min；
              ④6000rpm离心5min，仅留100μl上清液重悬细菌沉淀，并涂布至目标质粒抗性的LB平板上；（可使用本平台的平板涂布专用玻璃珠进行涂布，可以比传统涂布方法获得更多转化子）
              ⑤将平板正向培养1h，再倒置37℃培养14h。如果要求是30度则培养20h；
（菌落过多则将质粒稀释后再转化。没有菌落则加入10μl质粒转化。另不要直接转表达感受态，要先转克隆感受态，重提质粒后再导入表达感受态）
              ⑥挑取单菌落至LB液体培养基中，加入对应抗生素，220rpm震荡培养14h，根据实验需要和质粒提取试剂盒说明书提取质粒。
        2、甘油菌种（冰袋运输，存于-80℃，保质期90天，请务必划线挑单克隆培养）
              四区划线后挑单菌落培养，酵母菌需要先液体复苏再四区划线，再挑单菌落液体培养。
        3、穿刺菌种（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）
              穿刺接种，液体培养后四区划线，再挑单菌落液体培养。
        4、菌落平板（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）
              直接挑取单菌落至液体培养基中。
        5、液体质粒（冰袋运输，存于-20℃，保质期90天）
              单独提取的液体质粒收到后可直接使用。
        6、滤纸质粒（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
              收到货后将滤纸画圈部分剪下放入EP管中，加100ul无菌水将滤纸浸湿并浸泡5min，吸取5ul质粒转化，离心全涂。

二、转化图片

P2853/pENTR223-CLUAP1-C1201T(37-1242bp)人源基因质粒

P2854/pENTR223-NPM1(2点突变）人源基因质粒

P2855/pENTR223-SMPD2-G795T人源基因质粒

P2856/pENTR223-ARHGAP28（541-1713bp2同义突变2点突变）人源基因质粒

P2857/pENTR223-RBBP4（2同义突变）人源基因质粒

P2858/pENTR223-FKBP8（179-1239bp）人源基因质粒

P2859/pENTR223-FAM172A人源基因质粒

P2860/pENTR223-TRNT1（88-1305bp）人源基因质粒

P2861/pENTR223-SERPINF1（2同义突变）人源基因质粒

P2862/pENTR223-PSMC4人源基因质粒

P2863/pENTR223-NKAP(2点突变）人源基因质粒

P2864/pENTR223-IKBKG人源基因质粒