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- 详细信息
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-20
- 保质期：
2年
- 英文名：
p3×FLAG-CMV-13
- 库存：
100
- 供应商：
上海烜雅生物科技有限公司
- 规格：
干粉/液体
基本信息
名称：p3×FLAG-CMV-13哺乳表达质粒
别称: p3×FLAG-CMV-13
质粒属性
质粒简介
The p3XFLAG-CMV-13 Expression Vector is a 6.3kb derivative of pCMV5 used to establish expression of transient or unstable C-terminal 3XFLAG fusion proteins in mammalian cells. The vector encodes three adjacent FLAG epitopes (Asp-Tyr-Lys-Xaa-Xaa-Asp) downstream of the multiple cloning region. This results in increased detection sensitivity using ANTI-FLAG M2 antibody. The promoter-regulatory region of the human cytomegalovirus drives transcription of FLAG-fusion constructs. The preprotrypsin leader sequence precedes the FLAG sequence. The aminoglycoside phosphotransferase II gene (Neo) confers resistance to aminoglycosides such as G 418, allowing for selection of stable transfectants. p3XFLAG-CMV-13 Expression Vector is a shuttle vector for E. coli and mammalian cells. Efficiency of replication and genomic integration is optimal when using an SV40 T antigen-expressing host, such as COS cells.
质粒图谱
质粒序列
LOCUS Exported 6362 bp ds-DNA circular SYN 29-AUG-2016
DEFINITION synthetic circular DNA
ACCESSION .
VERSION .
KEYWORDS Untitled 13
SOURCE synthetic DNA construct
ORGANISM synthetic DNA construct
REFERENCE 1 (bases 1 to 6362)
AUTHORS .
TITLE Direct Submission
JOURNAL Exported Monday, August 29, 2016 from SnapGene Viewer 3.1.4
http://www.miaolingbio.com
FEATURES Location/Qualifiers
source 1..6362
/organism="synthetic DNA construct"
/mol_type="other DNA"
primer_bind 141..157
/note="M13 fwd"
/note="common sequencing primer, one of multiple similar
variants"
enhancer 318..697
/note="CMV enhancer"
/note="human cytomegalovirus immediate early enhancer"
promoter 698..901
/note="CMV promoter"
/note="human cytomegalovirus (CMV) immediate early
promoter"
CDS 931..975
/codon_start=1
/product="leader sequence from mouse preprotrypsin"
/note="preprotrypsin leader"
/translation="MSALLILALVGAAVA"
CDS 1045..1110
/codon_start=1
/product="three tandem FLAG(R) epitope tags, followed by an
enterokinase cleavage site"
/note="3xFLAG"
/translation="DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK"
polyA_signal 1121..1743
/note="hGH poly(A) signal"
/note="human growth hormone polyadenylation signal"
promoter 1785..2082
/note="SV40 promoter"
/note="SV40 enhancer and early promoter"
CDS 2136..2930
/codon_start=1
/gene="aph(3')-II (or nptII)"
/product="aminoglycoside phosphotransferase from Tn5"
/note="NeoR/KanR"
/note="confers resistance to neomycin, kanamycin, and G418
(Geneticin(R))"
/translation="MIEQDGLHAGSPAAWVERLFGYDWAQQTIGCSDAAVFRLSAQGRP
VLFVKTDLSGALNELQDEAARLSWLATTGVPCAAVLDVVTEAGRDWLLLGEVPGQDLLS
SHLAPAEKVSIMADAMRRLHTLDPAT-CPFDHQAKHRIERARTRMEAGLVDQDDLDEEHQ
GLAPAELFARLKARMPDGEDLVVTHGDACLPNIMVENGRFSGFIDCGRLGVADRYQDIA
LATRDIAEELGGEWADRFLVLYGIAAPDSQRIAFYRLLDEFF"
polyA_signal 3582..3716
/note="SV40 poly(A) signal"
/note="SV40 polyadenylation signal"
promoter complement(3722..3740)
/note="T7 promoter"
/note="promoter for bacteriophage T7 RNA polymerase"
primer_bind complement(3754..3770)
/note="M13 rev"
/note="common sequencing primer, one of multiple similar
variants"
protein_bind 3778..3794
/bound_moiety="lac repressor encoded by lacI"
/note="lac operator"
/note="The lac repressor binds to the lac operator to
inhibit transcription in E. coli. This inhibition can be
relieved by adding lactose or
isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)."
promoter complement(3802..3832)
/note="lac promoter"
/note="promoter for the E. coli lac operon"
protein_bind 3847..3868
/bound_moiety="E. coli catabolite activator protein"
/note="CAP binding site"
/note="CAP binding activates transcription in the presence
of cAMP."
rep_origin complement(4156..4744)
/direction=LEFT
/note="ori"
/note="high-copy-number ColE1/pMB1/pBR322/pUC origin of
replication"
CDS complement(4915..5775)
/codon_start=1
/gene="bla"
/product="beta-lactamase"
/note="AmpR"
/note="confers resistance to ampicillin, carbenicillin, and
related antibiotics"
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LIKHW"
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/gene="bla"
/note="AmpR promoter"
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/direction=RIGHT
/note="f1 ori"
/note="f1 bacteriophage origin of replication; arrow
indicates direction of (+) strand synthesis"
ORIGIN
1 ccattcgcca ttcaggctgc gcaactgttg ggaagggcga tcggtgcggg cctcttcgct
61 attacgccag ctggcgaaag ggggatgtgc tgcaaggcga ttaagttggg taacgccagg
121 gttttcccag tcacgacgtt gtaaaacgac ggccagtgcc aagctgatct atacattgaa
181 tcaatattgg caattagcca tattagtcat tggttatata gcataaatca atattggcta
241 ttggccattg catacgttgt atctatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc
301 aatatgaccg ccatgttgac attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg
361 gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc
421 gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat
481 agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc
541 ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtccg ccccctattg acgtcaatga
601 cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttacgggact ttcctacttg
661 gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacac
721 caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt
781 caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaataaccc
841 cgccccgttg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc
901 tcgtttagtg aaccgtcaga attacggacc atgtctgcac ttctgatcct agctcttgtt
961 ggagctgcag ttgctaagct tgcggccgcg aattcatcga tagatctgat atcggtacca
1021 gtcgactcta gaggatcccg ggctgactac aaagaccatg acggtgatta taaagatcat
1081 gacatcgact acaaggatga cgatgacaag tagtgatccc gggtggcatc cctgtgaccc
1141 ctccccagtg cctctcctgg ccctggaagt tgccactcca gtgcccacca gccttgtcct
1201 aataaaatta agttgcatca ttttgtctga ctaggtgtcc ttctataata ttatggggtg
1261 gaggggggtg gtatggagca aggggcaagt tgggaagaca acctgtaggg cctgcggggt
1321 ctattgggaa ccaagctgga gtgcagtggc acaatcttgg ctcactgcaa tctccgcctc
1381 ctgggttcaa gcgattctcc tgcctcagcc tcccgagttg ttgggattcc aggcatgcat
1441 gaccaggctc agctaatttt tgtttttttg gtagagacgg ggtttcacca tattggccag
1501 gctggtctcc aactcctaat ctcaggtgat ctacccacct tggcctccca aattgctggg
1561 attacaggcg tgaaccactg ctcccttccc tgtccttctg attttaaaat aactatacca
1621 gcaggaggac gtccagacac agcataggct acctggccat gcccaaccgg tgggacattt
1681 gagttgcttg cttggcactg tcctctcatg cgttgggtcc actcagtaga tgcctgttga
1741 attgggtacg cggccagctt ggctgtggaa tgtgtgtcag ttagggtgtg gaaagtcccc
1801 aggctcccca gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag caaccaggtg
1861 tggaaagtcc ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc
1921 agcaaccata gtcccgcccc taactccgcc catcccgccc ctaactccgc ccagttccgc
1981 ccattctccg ccccatggct gactaatttt ttttatttat gcagaggccg aggccgcctc
2041 ggcctctgag ctattccaga agtagtgagg aggctttttt ggaggaattg atcagcttgg
2101 gatctgatca agagacagga tgaggatcgt ttcgcatgat tgaacaagat ggattgcacg
2161 caggttctcc ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta tgactgggca caacagacaa
2221 tcggctgctc tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccg gttctttttg
2281 tcaagaccga cctgtccggt gccctgaatg aactgcagga cgaggcagcg cggctatcgt
2341 ggctggccac gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga cgttgtcact gaagcgggaa
2401 gggactggct gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatct caccttgctc
2461 ctgccgagaa agtatccatc atggctgatg caatgcggcg gctgcatacg cttgatccgg
2521 ctacctgccc attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgt actcggatgg
2581 aagccggtct tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca tcaggggctc gcgccagccg
2641 aactgttcgc caggctcaag gcgcgcatgc ccgacggcga ggatctcgtc gtgacccatg
2701 gcgatgcctg cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg cttttctgga ttcatcgact
2761 gtggccggct gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc gttggctacc cgtgatattg
2821 ctgaagagct tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggt atcgccgctc
2881 ccgattcgca gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctga gcgggactct
2941 ggggttcgaa atgaccgacc aagcgacgcc caacctgcca tcacgagatt tcgattccac
3001 cgccgccttc tatgaaaggt tgggcttcgg aatcgttttc cgggacgccg gctggatgat
3061 cctccagcgc ggggatctca tgctggagtt cttcgcccac cccgggctcg atcccctcgc
3121 gagttggttc agctgctgcc tgaggctgga cgacctcgcg gagttctacc ggcagtgcaa
3181 atccgtcggc atccaggaaa ccagcagcgg ctatccgcgc atccatgccc ccgaactgca
3241 ggagtgggga ggcacgatgg ccgctttggt cgacccggac gggacgctcc tgcgcctgat
3301 acagaacgaa ttgcttgcag gcatctcatg agtgtgtctt cccgttttcc gcctgaggtc
3361 actgcgtgga tggagcgctg gcgcctgctg cgcgacggcg agctgctcac cacccactcg
3421 ccaagctgga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgccgatca
3481 taatcagcca taccacattt gtagaggttt tacttgcttt aaaaaacctc ccacacctcc
3541 ccctgaacct gaaacataaa atgaatgcaa ttgttgttgt taacttgttt attgcagctt
3601 ataatggtta caaataaagc aatagcatca caaatttcac aaataaagca tttttttcac
3661 tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc ttatcatgtc tggatcaatt
3721 ccctatagtg agtcgtatta aattcgtaat catgtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg
3781 ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg
3841 tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc
3901 gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt
3961 gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct
4021 gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga
4081 taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc
4141 cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg
4201 ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg
4261 aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt
4321 tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt
4381 gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg
4441 cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact
4501 ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt
4561 cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct
4621 gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac
4681 cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc
4741 tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg
4801 ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta
4861 aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca
4921 atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc
4981 ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc
5041 tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc
5101 agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat
5161 taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt
5221 tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc
5281 cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag
5341 ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt
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6301 aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc gaattttaac aaaatattaa cgcttacaat
6361 tt
//
质粒菌株产品操作说明书
一、扩增流程
收到产品后，请先根据产品管壁标签来判断产品形式，并在扩增前准确查找该质粒菌株的抗性、感受态和培养温度。
1、质粒干粉（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
①收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min，再加入20μl ddH2O去离子水溶解质粒；
②取1支100μl 感受态于冰上解冻10min，加入2μl质粒，再冰浴30min后，42℃热激60s，不要搅动，再冰浴2min；（从第二步开始均要在超净工作台中无菌操作）
③加入900μl无抗的LB液体培养基，180rpm震荡37℃培养45min；
④6000rpm离心5min，仅留100μl上清液重悬细菌沉淀，并涂布至目标质粒抗性的LB平板上；（可使用本平台的平板涂布专用玻璃珠进行涂布，可以比传统涂布方法获得更多转化子）
⑤将平板正向培养1h，再倒置37℃培养14h。如果要求是30度则培养20h；
（菌落过多则将质粒稀释后再转化。没有菌落则加入10μl质粒转化。另不要直接转表达感受态，要先转克隆感受态，重提质粒后再导入表达感受态）
⑥挑取单菌落至LB液体培养基中，加入对应抗生素，220rpm震荡培养14h，根据实验需要和质粒提取试剂盒说明书提取质粒。
2、甘油菌种（冰袋运输，存于-80℃，保质期90天，请务必划线挑单克隆培养）
四区划线后挑单菌落培养，酵母菌需要先液体复苏再四区划线，再挑单菌落液体培养。
3、穿刺菌种（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）
穿刺接种，液体培养后四区划线，再挑单菌落液体培养。
4、菌落平板（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）
直接挑取单菌落至液体培养基中。
5、液体质粒（冰袋运输，存于-20℃，保质期90天）
单独提取的液体质粒收到后可直接使用。
6、滤纸质粒（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
收到货后将滤纸画圈部分剪下放入EP管中，加100ul无菌水将滤纸浸湿并浸泡5min，吸取5ul质粒转化，离心全涂。
二、转化图片
名称：p3×FLAG-CMV-13哺乳表达质粒
别称: p3×FLAG-CMV-13
| 启动子: | CMV |
|---|---|
| 复制子: | pUC |
| 终止子: | SV40 poly(A) signal,hGH poly(A) signal |
| 质粒分类: | 哺乳细胞，蛋白过表达载体 |
| 质粒大小: | 6362bp |
| 原核抗性: | Amp |
| 筛选标记: | G418 |
| 克隆菌株: | DH5a |
| 培养条件: | 37度 |
| 表达宿主: | 哺乳细胞 |
| 诱导方式: | 无须诱导，瞬时表达 |
| 5'测序引物: | CMV-F：CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG |
| 3'测序引物: | hGH-PA-R:CCAGCTTGGTTCCCAATAGA |
质粒属性
| 载体宿主： | 哺乳细胞 |
|---|---|
| 载体用途： | 蛋白表达 |
| 基因种属： | 空载体 |
| 基因类型： | ORF |
| 原核抗性： | Amp |
| 真核抗性： | Neo/G418 |
| 荧光蛋白： |
质粒简介
The p3XFLAG-CMV-13 Expression Vector is a 6.3kb derivative of pCMV5 used to establish expression of transient or unstable C-terminal 3XFLAG fusion proteins in mammalian cells. The vector encodes three adjacent FLAG epitopes (Asp-Tyr-Lys-Xaa-Xaa-Asp) downstream of the multiple cloning region. This results in increased detection sensitivity using ANTI-FLAG M2 antibody. The promoter-regulatory region of the human cytomegalovirus drives transcription of FLAG-fusion constructs. The preprotrypsin leader sequence precedes the FLAG sequence. The aminoglycoside phosphotransferase II gene (Neo) confers resistance to aminoglycosides such as G 418, allowing for selection of stable transfectants. p3XFLAG-CMV-13 Expression Vector is a shuttle vector for E. coli and mammalian cells. Efficiency of replication and genomic integration is optimal when using an SV40 T antigen-expressing host, such as COS cells.
质粒图谱
质粒序列
LOCUS Exported 6362 bp ds-DNA circular SYN 29-AUG-2016
DEFINITION synthetic circular DNA
ACCESSION .
VERSION .
KEYWORDS Untitled 13
SOURCE synthetic DNA construct
ORGANISM synthetic DNA construct
REFERENCE 1 (bases 1 to 6362)
AUTHORS .
TITLE Direct Submission
JOURNAL Exported Monday, August 29, 2016 from SnapGene Viewer 3.1.4
http://www.miaolingbio.com
FEATURES Location/Qualifiers
source 1..6362
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variants"
protein_bind 3778..3794
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/note="lac operator"
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inhibit transcription in E. coli. This inhibition can be
relieved by adding lactose or
isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)."
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/note="CAP binding activates transcription in the presence
of cAMP."
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replication"
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related antibiotics"
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/gene="bla"
/note="AmpR promoter"
rep_origin 5907..6362
/direction=RIGHT
/note="f1 ori"
/note="f1 bacteriophage origin of replication; arrow
indicates direction of (+) strand synthesis"
ORIGIN
1 ccattcgcca ttcaggctgc gcaactgttg ggaagggcga tcggtgcggg cctcttcgct
61 attacgccag ctggcgaaag ggggatgtgc tgcaaggcga ttaagttggg taacgccagg
121 gttttcccag tcacgacgtt gtaaaacgac ggccagtgcc aagctgatct atacattgaa
181 tcaatattgg caattagcca tattagtcat tggttatata gcataaatca atattggcta
241 ttggccattg catacgttgt atctatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc
301 aatatgaccg ccatgttgac attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg
361 gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc
421 gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat
481 agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc
541 ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtccg ccccctattg acgtcaatga
601 cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttacgggact ttcctacttg
661 gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacac
721 caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt
781 caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaataaccc
841 cgccccgttg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc
901 tcgtttagtg aaccgtcaga attacggacc atgtctgcac ttctgatcct agctcttgtt
961 ggagctgcag ttgctaagct tgcggccgcg aattcatcga tagatctgat atcggtacca
1021 gtcgactcta gaggatcccg ggctgactac aaagaccatg acggtgatta taaagatcat
1081 gacatcgact acaaggatga cgatgacaag tagtgatccc gggtggcatc cctgtgaccc
1141 ctccccagtg cctctcctgg ccctggaagt tgccactcca gtgcccacca gccttgtcct
1201 aataaaatta agttgcatca ttttgtctga ctaggtgtcc ttctataata ttatggggtg
1261 gaggggggtg gtatggagca aggggcaagt tgggaagaca acctgtaggg cctgcggggt
1321 ctattgggaa ccaagctgga gtgcagtggc acaatcttgg ctcactgcaa tctccgcctc
1381 ctgggttcaa gcgattctcc tgcctcagcc tcccgagttg ttgggattcc aggcatgcat
1441 gaccaggctc agctaatttt tgtttttttg gtagagacgg ggtttcacca tattggccag
1501 gctggtctcc aactcctaat ctcaggtgat ctacccacct tggcctccca aattgctggg
1561 attacaggcg tgaaccactg ctcccttccc tgtccttctg attttaaaat aactatacca
1621 gcaggaggac gtccagacac agcataggct acctggccat gcccaaccgg tgggacattt
1681 gagttgcttg cttggcactg tcctctcatg cgttgggtcc actcagtaga tgcctgttga
1741 attgggtacg cggccagctt ggctgtggaa tgtgtgtcag ttagggtgtg gaaagtcccc
1801 aggctcccca gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag caaccaggtg
1861 tggaaagtcc ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc
1921 agcaaccata gtcccgcccc taactccgcc catcccgccc ctaactccgc ccagttccgc
1981 ccattctccg ccccatggct gactaatttt ttttatttat gcagaggccg aggccgcctc
2041 ggcctctgag ctattccaga agtagtgagg aggctttttt ggaggaattg atcagcttgg
2101 gatctgatca agagacagga tgaggatcgt ttcgcatgat tgaacaagat ggattgcacg
2161 caggttctcc ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta tgactgggca caacagacaa
2221 tcggctgctc tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccg gttctttttg
2281 tcaagaccga cctgtccggt gccctgaatg aactgcagga cgaggcagcg cggctatcgt
2341 ggctggccac gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga cgttgtcact gaagcgggaa
2401 gggactggct gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatct caccttgctc
2461 ctgccgagaa agtatccatc atggctgatg caatgcggcg gctgcatacg cttgatccgg
2521 ctacctgccc attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgt actcggatgg
2581 aagccggtct tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca tcaggggctc gcgccagccg
2641 aactgttcgc caggctcaag gcgcgcatgc ccgacggcga ggatctcgtc gtgacccatg
2701 gcgatgcctg cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg cttttctgga ttcatcgact
2761 gtggccggct gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc gttggctacc cgtgatattg
2821 ctgaagagct tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggt atcgccgctc
2881 ccgattcgca gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctga gcgggactct
2941 ggggttcgaa atgaccgacc aagcgacgcc caacctgcca tcacgagatt tcgattccac
3001 cgccgccttc tatgaaaggt tgggcttcgg aatcgttttc cgggacgccg gctggatgat
3061 cctccagcgc ggggatctca tgctggagtt cttcgcccac cccgggctcg atcccctcgc
3121 gagttggttc agctgctgcc tgaggctgga cgacctcgcg gagttctacc ggcagtgcaa
3181 atccgtcggc atccaggaaa ccagcagcgg ctatccgcgc atccatgccc ccgaactgca
3241 ggagtgggga ggcacgatgg ccgctttggt cgacccggac gggacgctcc tgcgcctgat
3301 acagaacgaa ttgcttgcag gcatctcatg agtgtgtctt cccgttttcc gcctgaggtc
3361 actgcgtgga tggagcgctg gcgcctgctg cgcgacggcg agctgctcac cacccactcg
3421 ccaagctgga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgccgatca
3481 taatcagcca taccacattt gtagaggttt tacttgcttt aaaaaacctc ccacacctcc
3541 ccctgaacct gaaacataaa atgaatgcaa ttgttgttgt taacttgttt attgcagctt
3601 ataatggtta caaataaagc aatagcatca caaatttcac aaataaagca tttttttcac
3661 tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc ttatcatgtc tggatcaatt
3721 ccctatagtg agtcgtatta aattcgtaat catgtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg
3781 ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg
3841 tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc
3901 gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt
3961 gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct
4021 gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga
4081 taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc
4141 cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg
4201 ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg
4261 aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt
4321 tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt
4381 gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg
4441 cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact
4501 ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt
4561 cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct
4621 gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac
4681 cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc
4741 tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg
4801 ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta
4861 aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca
4921 atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc
4981 ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc
5041 tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc
5101 agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat
5161 taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt
5221 tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc
5281 cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag
5341 ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt
5401 tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac
5461 tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg
5521 cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat
5581 tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc
5641 gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc
5701 tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa
5761 atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg
5821 tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg
5881 cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgc gccctgtagc ggcgcattaa gcgcggcggg
5941 tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc gccctagcgc ccgctccttt
6001 cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag ctctaaatcg
6061 ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac ctcgacccca aaaaacttga
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6181 gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa actggaacaa cactcaaccc
6241 tatctcggtc tattcttttg atttataagg gattttgccg atttcggcct attggttaaa
6301 aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc gaattttaac aaaatattaa cgcttacaat
6361 tt
//
质粒菌株产品操作说明书
一、扩增流程
收到产品后，请先根据产品管壁标签来判断产品形式，并在扩增前准确查找该质粒菌株的抗性、感受态和培养温度。
1、质粒干粉（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
①收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min，再加入20μl ddH2O去离子水溶解质粒；
②取1支100μl 感受态于冰上解冻10min，加入2μl质粒，再冰浴30min后，42℃热激60s，不要搅动，再冰浴2min；（从第二步开始均要在超净工作台中无菌操作）
③加入900μl无抗的LB液体培养基，180rpm震荡37℃培养45min；
④6000rpm离心5min，仅留100μl上清液重悬细菌沉淀，并涂布至目标质粒抗性的LB平板上；（可使用本平台的平板涂布专用玻璃珠进行涂布，可以比传统涂布方法获得更多转化子）
⑤将平板正向培养1h，再倒置37℃培养14h。如果要求是30度则培养20h；
（菌落过多则将质粒稀释后再转化。没有菌落则加入10μl质粒转化。另不要直接转表达感受态，要先转克隆感受态，重提质粒后再导入表达感受态）
⑥挑取单菌落至LB液体培养基中，加入对应抗生素，220rpm震荡培养14h，根据实验需要和质粒提取试剂盒说明书提取质粒。
2、甘油菌种（冰袋运输，存于-80℃，保质期90天，请务必划线挑单克隆培养）
四区划线后挑单菌落培养，酵母菌需要先液体复苏再四区划线，再挑单菌落液体培养。
3、穿刺菌种（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）
穿刺接种，液体培养后四区划线，再挑单菌落液体培养。
4、菌落平板（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）
直接挑取单菌落至液体培养基中。
5、液体质粒（冰袋运输，存于-20℃，保质期90天）
单独提取的液体质粒收到后可直接使用。
6、滤纸质粒（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
收到货后将滤纸画圈部分剪下放入EP管中，加100ul无菌水将滤纸浸湿并浸泡5min，吸取5ul质粒转化，离心全涂。
二、转化图片
| P2737/pENTR223-RGS4人源基因质粒 |
| P2738/pENTR223-LC3人源基因质粒 |
| P2739/pENTR223-UBE2T人源基因质粒 |
| P2740/pENTR223-RPL13A人源基因质粒 |
| P2741/pENTR223-ZMAT5人源基因质粒 |
| P2742/pENTR223-AHSP人源基因质粒 |
| P2743/pENTR223-RSRP1-A716G人源基因质粒 |
| P2744/pENTR223-IFI27L2人源基因质粒 |
| P2745/pENTR223-NT5C3A（136-996bp）人源基因质粒 |
| P2746/pENTR223-MT1M人源基因质粒 |
| P2747/pENTR223-SPIN3人源基因质粒 |
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文献和实验相关实验
蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。 mRFP-GFP-LC3 双荧光自噬指示体系： mRFP-GFP-LC3 融合蛋白的病毒产品 mRFP 用于标记及追踪 LC3，GFP 的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体。由于 GFP 荧光蛋白对酸性敏感(pH 敏感)，当自噬体与溶酶体融合后 GFP 荧光发生淬灭,而 mRFP 相对稳定，因此只能检测到红色荧光。 1. 哺乳动物 LC3 表达质粒
pCF-T M13F M13R pCI T7（17Base） 此载体无反向引物 pCI-neo T7（17Base） T3 pCMS-EGFP T7 T3 pCMV-3Tag-4A T3 /PFLAG-CMV-F T7 pCMV5 pCMV5F pCMV5R pCMV5-Flag pCMV5F pCMV5R pCMV-MYC/HA pCMV-F pCMV-R pCMV-Sport M13F/T7 SP6/M13R pCMV-Tag(KAN+) T3 T7 pCR2.1-TOPO
相关专题引物设计载体 名称上游引物 （ 5'primer ）下游引物（ 3'primer ）P3*FLAG-CMVCMV-30(825-854)CMV-24(1129-1152)pAc5.1/V5-His(_A,_B,_C)pAc5-5BGH revpAcG2TpGEX-5not availablepACTT7EEVT3/EBVrevpACT2GAL4 ADforpGAL4-ADrvpACT2p17110p12584pACYC184(BamHI-site
p3×FLAG-CMV-13哺乳表达质粒
￥100 - 1000
