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- 详细信息
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- 技术资料
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-20
- 保质期：
2年
- 英文名：
pET-Duet
- 库存：
100
- 供应商：
上海烜雅生物科技有限公司
- 规格：
干粉/液体
基本信息
名称：pETDuet-1大肠双表达质粒
别称: pET-Duet
质粒属性
质粒简介
pETDuet-1载体被设计用来在大肠杆菌中同时表达两个外源基因. 载体含有两个多克隆位点，每一个多克隆位点是通过T7启动子/Lac操纵子和一个核糖体结合位点组成。pETDuet-1携带有pBR322质粒来源的ColE1复制子, lacI基因和氨苄抗性基因。本载体可以与pACYCDuet-1载体联合使用，在合适的宿主菌中，可以一起共表达至多4个目的基因。插入在pETDuet-1载体多克隆位点1的目的基因可以使用pET Upstream 引物和DuetDOWN1 引物进行测序，插入在多克隆位点2的目的基因可以通过DuetUP2 引物 和T7 Terminator 引物进行目的基因测序。
质粒图谱
质粒序列
LOCUS Exported 5420 bp ds-DNA circular SYN 13-8-2015
DEFINITION synthetic circular DNA
ACCESSION .
VERSION .
KEYWORDS Untitled
SOURCE synthetic DNA construct
ORGANISM synthetic DNA construct
REFERENCE 1 (bases 1 to 5420)
AUTHORS .
TITLE Direct Submission
JOURNAL Exported 2015-8-13 from MLCC
http://www.miaolingbio.com
FEATURES Location/Qualifiers
source 1..5420
/organism="synthetic DNA construct"
/mol_type="other DNA"
source 42..64
/organism="Enterobacteria phage T7"
/mol_type="genomic DNA"
/db_xref="taxon:10760"
protein_bind 3..27
/bound_moiety="lac repressor encoded by lacI"
/note="lac operator"
/note="The lac repressor binds to the lac operator to
inhibit transcription in E. coli. This inhibition can be
relieved by adding lactose or
isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)."
RBS 42..64
/note="efficient ribosome binding site from bacteriophage
T7 gene 10 (Olins and Rangwala, 1989)"
CDS 83..100
/codon_start=1
/product="6xHis affinity tag"
/note="6xHis"
/translation="HHHHHH"
promoter 214..232
/note="T7 promoter"
/note="promoter for bacteriophage T7 RNA polymerase"
protein_bind 233..257
/bound_moiety="lac repressor encoded by lacI"
/note="lac operator"
/note="The lac repressor binds to the lac operator to
inhibit transcription in E. coli. This inhibition can be
relieved by adding lactose or
isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)."
CDS 366..410
/codon_start=1
/product="affinity and epitope tag derived from pancreatic
ribonuclease A"
/note="S-Tag"
/translation="KETAAAKFERQHMDS"
terminator 462..509
/note="T7 terminator"
/note="transcription terminator for bacteriophage T7 RNA
polymerase"
rep_origin 546..1001
/direction=RIGHT
/note="f1 ori"
/note="f1 bacteriophage origin of replication; arrow
indicates direction of (+) strand synthesis"
CDS complement(1116..1976)
/codon_start=1
/gene="bla"
/product="beta-lactamase"
/note="AmpR"
/note="confers resistance to ampicillin, carbenicillin, and
related antibiotics"
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ELDLNSGKILESFRPEERFPMMSTFKVLLCGAVLSRIDAGQEQLGRRIHYSQNDLVEYS
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EPELNEAIPNDERDTTMPVAMATTLRKLLTGELLTLASRQQLIDWMEADKVAGPLLRSA
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LIKHW"
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/note="AmpR promoter"
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/note="ori"
/note="high-copy-number ColE1/pMB1/pBR322/pUC origin of
replication"
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/note="bom"
/note="basis of mobility region from pBR322"
CDS complement(3168..3359)
/codon_start=1
/gene="rop"
/product="Rop protein, which maintains plasmids at low copy
number"
/note="rop"
/translation="MTKQEKTALNMARFIRSQTLTLLEKLNELDADEQADICESLHDHA
DELYRSCLARFGDDGENL"
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/codon_start=1
/gene="lacI"
/product="lac repressor"
/note="lacI"
/note="The lac repressor binds to the lac operator to
inhibit transcription in E. coli. This inhibition can be
relieved by adding lactose or
isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)."
/translation="MKPVTLYDVAEYAGVSYQTVSRVVNQASHVSAKTREKVEAAMAEL
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ALADSLMQLARQVSRLESGQ"
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/gene="lacI"
/note="lacI promoter"
promoter 5404..2
/note="T7 promoter"
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ORIGIN
1 ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa ttttgtttaa ctttaagaag
61 gagatatacc atgggcagca gccatcacca tcatcaccac agccaggatc cgaattcgag
121 ctcggcgcgc ctgcaggtcg acaagcttgc ggccgcataa tgcttaagtc gaacagaaag
181 taatcgtatt gtacacggcc gcataatcga aattaatacg actcactata ggggaattgt
241 gagcggataa caattcccca tcttagtata ttagttaagt ataagaagga gatatacata
301 tggcagatct caattggata tcggccggcc acgcgatcgc tgacgtcggt accctcgagt
361 ctggtaaaga aaccgctgct gcgaaatttg aacgccagca catggactcg tctactagcg
421 cagcttaatt aacctaggct gctgccaccg ctgagcaata actagcataa ccccttgggg
481 cctctaaacg ggtcttgagg ggttttttgc tgaaaggagg aactatatcc ggattggcga
541 atgggacgcg ccctgtagcg gcgcattaag cgcggcgggt gtggtggtta cgcgcagcgt
601 gaccgctaca cttgccagcg ccctagcgcc cgctcctttc gctttcttcc cttcctttct
661 cgccacgttc gccggctttc cccgtcaagc tctaaatcgg gggctccctt tagggttccg
721 atttagtgct ttacggcacc tcgaccccaa aaaacttgat tagggtgatg gttcacgtag
781 tgggccatcg ccctgataga cggtttttcg ccctttgacg ttggagtcca cgttctttaa
841 tagtggactc ttgttccaaa ctggaacaac actcaaccct atctcggtct attcttttga
901 tttataaggg attttgccga tttcggccta ttggttaaaa aatgagctga tttaacaaaa
961 atttaacgcg aattttaaca aaatattaac gtttacaatt tctggcggca cgatggcatg
1021 agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca
1081 atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca
1141 cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag
1201 ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac
1261 ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc
1321 agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct
1381 agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc
1441 gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg
1501 cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc
1561 gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat
1621 tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag
1681 tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat
1741 aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg
1801 cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca
1861 cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga
1921 aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc
1981 ttcctttttc aatcatgatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat
2041 atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggtcatgac caaaatccct taacgtgagt
2101 tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt
2161 tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt
2221 gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc
2281 agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg
2341 tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg
2401 ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt
2461 cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac
2521 tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg
2581 acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg
2641 gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat
2701 ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt
2761 tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg
2821 attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa
2881 cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcctgatg cggtattttc
2941 tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatatatgg tgcactctca gtacaatctg
3001 ctctgatgcc gcatagttaa gccagtatac actccgctat cgctacgtga ctgggtcatg
3061 gctgcgcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct gacgggcttg tctgctcccg
3121 gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct gcatgtgtca gaggttttca
3181 ccgtcatcac cgaaacgcgc gaggcagctg cggtaaagct catcagcgtg gtcgtgaagc
3241 gattcacaga tgtctgcctg ttcatccgcg tccagctcgt tgagtttctc cagaagcgtt
3301 aatgtctggc ttctgataaa gcgggccatg ttaagggcgg ttttttcctg tttggtcact
3361 gatgcctccg tgtaaggggg atttctgttc atgggggtaa tgataccgat gaaacgagag
3421 aggatgctca cgatacgggt tactgatgat gaacatgccc ggttactgga acgttgtgag
3481 ggtaaacaac tggcggtatg gatgcggcgg gaccagagaa aaatcactca gggtcaatgc
3541 cagcgcttcg ttaatacaga tgtaggtgtt ccacagggta gccagcagca tcctgcgatg
3601 cagatccgga acataatggt gcagggcgct gacttccgcg tttccagact ttacgaaaca
3661 cggaaaccga agaccattca tgttgttgct caggtcgcag acgttttgca gcagcagtcg
3721 cttcacgttc gctcgcgtat cggtgattca ttctgctaac cagtaaggca accccgccag
3781 cctagccggg tcctcaacga caggagcacg atcatgctag tcatgccccg cgcccaccgg
3841 aaggagctga ctgggttgaa ggctctcaag ggcatcggtc gagatcccgg tgcctaatga
3901 gtgagctaac ttacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg
3961 tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg
4021 cgccagggtg gtttttcttt tcaccagtga gacgggcaac agctgattgc ccttcaccgc
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4201 cactaccgag atgtccgcac caacgcgcag cccggactcg gtaatggcgc gcattgcgcc
4261 cagcgccatc tgatcgttgg caaccagcat cgcagtggga acgatgccct cattcagcat
4321 ttgcatggtt tgttgaaaac cggacatggc actccagtcg ccttcccgtt ccgctatcgg
4381 ctgaatttga ttgcgagtga gatatttatg ccagccagcc agacgcagac gcgccgagac
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4981 ctctgcgaca tcgtataacg ttactggttt cacattcacc accctgaatt gactctcttc
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5281 cccgatcttc cccatcggtg atgtcggcga tataggcgcc agcaaccgca cctgtggcgc
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5401 aattaatacg actcactata
//
质粒菌株产品操作说明书
一、扩增流程
收到产品后，请先根据产品管壁标签来判断产品形式，并在扩增前准确查找该质粒菌株的抗性、感受态和培养温度。
1、质粒干粉（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
①收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min，再加入20μl ddH2O去离子水溶解质粒；
②取1支100μl 感受态于冰上解冻10min，加入2μl质粒，再冰浴30min后，42℃热激60s，不要搅动，再冰浴2min；（从第二步开始均要在超净工作台中无菌操作）
③加入900μl无抗的LB液体培养基，180rpm震荡37℃培养45min；
④6000rpm离心5min，仅留100μl上清液重悬细菌沉淀，并涂布至目标质粒抗性的LB平板上；（可使用本平台的平板涂布专用玻璃珠进行涂布，可以比传统涂布方法获得更多转化子）
⑤将平板正向培养1h，再倒置37℃培养14h。如果要求是30度则培养20h；
（菌落过多则将质粒稀释后再转化。没有菌落则加入10μl质粒转化。另不要直接转表达感受态，要先转克隆感受态，重提质粒后再导入表达感受态）
⑥挑取单菌落至LB液体培养基中，加入对应抗生素，220rpm震荡培养14h，根据实验需要和质粒提取试剂盒说明书提取质粒。
2、甘油菌种（冰袋运输，存于-80℃，保质期90天，请务必划线挑单克隆培养）
四区划线后挑单菌落培养，酵母菌需要先液体复苏再四区划线，再挑单菌落液体培养。
3、穿刺菌种（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）
穿刺接种，液体培养后四区划线，再挑单菌落液体培养。
4、菌落平板（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）
直接挑取单菌落至液体培养基中。
5、液体质粒（冰袋运输，存于-20℃，保质期90天）
单独提取的液体质粒收到后可直接使用。
6、滤纸质粒（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
收到货后将滤纸画圈部分剪下放入EP管中，加100ul无菌水将滤纸浸湿并浸泡5min，吸取5ul质粒转化，离心全涂。
二、转化图片
名称：pETDuet-1大肠双表达质粒
别称: pET-Duet
| 启动子: | T7 |
|---|---|
| 复制子: | pBR322 |
| 终止子: | T7 terminator |
| 质粒分类: | 大肠杆菌载体；双表达框质粒 |
| 质粒大小: | 5420bp |
| 质粒标签: | N-6×His,C-S |
| 克隆菌株: | DH5a |
| 培养条件: | 37度 |
| 表达宿主: | BL21(DE3) |
| 培养条件: | 37℃，有氧，LB |
| 诱导方式: | IPTG或乳糖及其类似物 |
| 5'测序引物: | pET Upstream：ATGCGTCCGGCGTAGA DuetUP2:TTGTACACGGCCGCATAATC |
| 3'测序引物: | DuetDOWN1:GATTAGCGGCCGTGTACAA T7-ter:TGCTAGTTATTGCTCAGCGG |
| 备注: | 同时表达两个外源蛋白 |
质粒属性
| 载体宿主： | 大肠杆菌 |
|---|---|
| 载体用途： | 蛋白表达 |
| 基因种属： | 多框空载 |
| 基因类型： | ORF |
| 原核抗性： | Amp |
| 真核抗性： | |
| 荧光蛋白： |
质粒简介
pETDuet-1载体被设计用来在大肠杆菌中同时表达两个外源基因. 载体含有两个多克隆位点，每一个多克隆位点是通过T7启动子/Lac操纵子和一个核糖体结合位点组成。pETDuet-1携带有pBR322质粒来源的ColE1复制子, lacI基因和氨苄抗性基因。本载体可以与pACYCDuet-1载体联合使用，在合适的宿主菌中，可以一起共表达至多4个目的基因。插入在pETDuet-1载体多克隆位点1的目的基因可以使用pET Upstream 引物和DuetDOWN1 引物进行测序，插入在多克隆位点2的目的基因可以通过DuetUP2 引物 和T7 Terminator 引物进行目的基因测序。
质粒图谱
质粒序列
LOCUS Exported 5420 bp ds-DNA circular SYN 13-8-2015
DEFINITION synthetic circular DNA
ACCESSION .
VERSION .
KEYWORDS Untitled
SOURCE synthetic DNA construct
ORGANISM synthetic DNA construct
REFERENCE 1 (bases 1 to 5420)
AUTHORS .
TITLE Direct Submission
JOURNAL Exported 2015-8-13 from MLCC
http://www.miaolingbio.com
FEATURES Location/Qualifiers
source 1..5420
/organism="synthetic DNA construct"
/mol_type="other DNA"
source 42..64
/organism="Enterobacteria phage T7"
/mol_type="genomic DNA"
/db_xref="taxon:10760"
protein_bind 3..27
/bound_moiety="lac repressor encoded by lacI"
/note="lac operator"
/note="The lac repressor binds to the lac operator to
inhibit transcription in E. coli. This inhibition can be
relieved by adding lactose or
isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)."
RBS 42..64
/note="efficient ribosome binding site from bacteriophage
T7 gene 10 (Olins and Rangwala, 1989)"
CDS 83..100
/codon_start=1
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inhibit transcription in E. coli. This inhibition can be
relieved by adding lactose or
isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)."
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CDS complement(3168..3359)
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/gene="lacI"
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inhibit transcription in E. coli. This inhibition can be
relieved by adding lactose or
isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)."
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NYIPNRVAQQLAGKQSLLIGVATSSLALHAPSQIVAAIKSRADQLGASVVVSMVERSGV
EACKAAVHNLLAQRVSGLIINYPLDDQDAIAVEAACTNVPALFLDVSDQTPINSIIFSH
EDGTRLGVEHLVALGHQQIALLAGPLSSVSARLRLAGWHKYLTRNQIQPIAEREGDWSA
MSGFQQTMQMLNEGIVPTAMLVANDQMALGAMRAITESGLRVGADISVVGYDDTEDSSC
YIPPLTTIKQDFRLLGQTSVDRLLQLSQGQAVKGNQLLPVSLVKRKTTLAPNTQTASPR
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ORIGIN
1 ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa ttttgtttaa ctttaagaag
61 gagatatacc atgggcagca gccatcacca tcatcaccac agccaggatc cgaattcgag
121 ctcggcgcgc ctgcaggtcg acaagcttgc ggccgcataa tgcttaagtc gaacagaaag
181 taatcgtatt gtacacggcc gcataatcga aattaatacg actcactata ggggaattgt
241 gagcggataa caattcccca tcttagtata ttagttaagt ataagaagga gatatacata
301 tggcagatct caattggata tcggccggcc acgcgatcgc tgacgtcggt accctcgagt
361 ctggtaaaga aaccgctgct gcgaaatttg aacgccagca catggactcg tctactagcg
421 cagcttaatt aacctaggct gctgccaccg ctgagcaata actagcataa ccccttgggg
481 cctctaaacg ggtcttgagg ggttttttgc tgaaaggagg aactatatcc ggattggcga
541 atgggacgcg ccctgtagcg gcgcattaag cgcggcgggt gtggtggtta cgcgcagcgt
601 gaccgctaca cttgccagcg ccctagcgcc cgctcctttc gctttcttcc cttcctttct
661 cgccacgttc gccggctttc cccgtcaagc tctaaatcgg gggctccctt tagggttccg
721 atttagtgct ttacggcacc tcgaccccaa aaaacttgat tagggtgatg gttcacgtag
781 tgggccatcg ccctgataga cggtttttcg ccctttgacg ttggagtcca cgttctttaa
841 tagtggactc ttgttccaaa ctggaacaac actcaaccct atctcggtct attcttttga
901 tttataaggg attttgccga tttcggccta ttggttaaaa aatgagctga tttaacaaaa
961 atttaacgcg aattttaaca aaatattaac gtttacaatt tctggcggca cgatggcatg
1021 agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca
1081 atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca
1141 cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag
1201 ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac
1261 ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc
1321 agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct
1381 agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc
1441 gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg
1501 cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc
1561 gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat
1621 tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag
1681 tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat
1741 aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg
1801 cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca
1861 cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga
1921 aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc
1981 ttcctttttc aatcatgatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat
2041 atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggtcatgac caaaatccct taacgtgagt
2101 tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt
2161 tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt
2221 gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc
2281 agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg
2341 tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg
2401 ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt
2461 cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac
2521 tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg
2581 acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg
2641 gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat
2701 ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt
2761 tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg
2821 attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa
2881 cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcctgatg cggtattttc
2941 tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatatatgg tgcactctca gtacaatctg
3001 ctctgatgcc gcatagttaa gccagtatac actccgctat cgctacgtga ctgggtcatg
3061 gctgcgcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct gacgggcttg tctgctcccg
3121 gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct gcatgtgtca gaggttttca
3181 ccgtcatcac cgaaacgcgc gaggcagctg cggtaaagct catcagcgtg gtcgtgaagc
3241 gattcacaga tgtctgcctg ttcatccgcg tccagctcgt tgagtttctc cagaagcgtt
3301 aatgtctggc ttctgataaa gcgggccatg ttaagggcgg ttttttcctg tttggtcact
3361 gatgcctccg tgtaaggggg atttctgttc atgggggtaa tgataccgat gaaacgagag
3421 aggatgctca cgatacgggt tactgatgat gaacatgccc ggttactgga acgttgtgag
3481 ggtaaacaac tggcggtatg gatgcggcgg gaccagagaa aaatcactca gggtcaatgc
3541 cagcgcttcg ttaatacaga tgtaggtgtt ccacagggta gccagcagca tcctgcgatg
3601 cagatccgga acataatggt gcagggcgct gacttccgcg tttccagact ttacgaaaca
3661 cggaaaccga agaccattca tgttgttgct caggtcgcag acgttttgca gcagcagtcg
3721 cttcacgttc gctcgcgtat cggtgattca ttctgctaac cagtaaggca accccgccag
3781 cctagccggg tcctcaacga caggagcacg atcatgctag tcatgccccg cgcccaccgg
3841 aaggagctga ctgggttgaa ggctctcaag ggcatcggtc gagatcccgg tgcctaatga
3901 gtgagctaac ttacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg
3961 tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg
4021 cgccagggtg gtttttcttt tcaccagtga gacgggcaac agctgattgc ccttcaccgc
4081 ctggccctga gagagttgca gcaagcggtc cacgctggtt tgccccagca ggcgaaaatc
4141 ctgtttgatg gtggttaacg gcgggatata acatgagctg tcttcggtat cgtcgtatcc
4201 cactaccgag atgtccgcac caacgcgcag cccggactcg gtaatggcgc gcattgcgcc
4261 cagcgccatc tgatcgttgg caaccagcat cgcagtggga acgatgccct cattcagcat
4321 ttgcatggtt tgttgaaaac cggacatggc actccagtcg ccttcccgtt ccgctatcgg
4381 ctgaatttga ttgcgagtga gatatttatg ccagccagcc agacgcagac gcgccgagac
4441 agaacttaat gggcccgcta acagcgcgat ttgctggtga cccaatgcga ccagatgctc
4501 cacgcccagt cgcgtaccgt cttcatggga gaaaataata ctgttgatgg gtgtctggtc
4561 agagacatca agaaataacg ccggaacatt agtgcaggca gcttccacag caatggcatc
4621 ctggtcatcc agcggatagt taatgatcag cccactgacg cgttgcgcga gaagattgtg
4681 caccgccgct ttacaggctt cgacgccgct tcgttctacc atcgacacca ccacgctggc
4741 acccagttga tcggcgcgag atttaatcgc cgcgacaatt tgcgacggcg cgtgcagggc
4801 cagactggag gtggcaacgc caatcagcaa cgactgtttg cccgccagtt gttgtgccac
4861 gcggttggga atgtaattca gctccgccat cgccgcttcc actttttccc gcgttttcgc
4921 agaaacgtgg ctggcctggt tcaccacgcg ggaaacggtc tgataagaga caccggcata
4981 ctctgcgaca tcgtataacg ttactggttt cacattcacc accctgaatt gactctcttc
5041 cgggcgctat catgccatac cgcgaaaggt tttgcgccat tcgatggtgt ccgggatctc
5101 gacgctctcc cttatgcgac tcctgcatta ggaagcagcc cagtagtagg ttgaggccgt
5161 tgagcaccgc cgccgcaagg aatggtgcat gcaaggagat ggcgcccaac agtcccccgg
5221 ccacggggcc tgccaccata cccacgccga aacaagcgct catgagcccg aagtggcgag
5281 cccgatcttc cccatcggtg atgtcggcga tataggcgcc agcaaccgca cctgtggcgc
5341 cggtgatgcc ggccacgatg cgtccggcgt agaggatcga gatcgatctc gatcccgcga
5401 aattaatacg actcactata
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质粒菌株产品操作说明书
一、扩增流程
收到产品后，请先根据产品管壁标签来判断产品形式，并在扩增前准确查找该质粒菌株的抗性、感受态和培养温度。
1、质粒干粉（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
①收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min，再加入20μl ddH2O去离子水溶解质粒；
②取1支100μl 感受态于冰上解冻10min，加入2μl质粒，再冰浴30min后，42℃热激60s，不要搅动，再冰浴2min；（从第二步开始均要在超净工作台中无菌操作）
③加入900μl无抗的LB液体培养基，180rpm震荡37℃培养45min；
④6000rpm离心5min，仅留100μl上清液重悬细菌沉淀，并涂布至目标质粒抗性的LB平板上；（可使用本平台的平板涂布专用玻璃珠进行涂布，可以比传统涂布方法获得更多转化子）
⑤将平板正向培养1h，再倒置37℃培养14h。如果要求是30度则培养20h；
（菌落过多则将质粒稀释后再转化。没有菌落则加入10μl质粒转化。另不要直接转表达感受态，要先转克隆感受态，重提质粒后再导入表达感受态）
⑥挑取单菌落至LB液体培养基中，加入对应抗生素，220rpm震荡培养14h，根据实验需要和质粒提取试剂盒说明书提取质粒。
2、甘油菌种（冰袋运输，存于-80℃，保质期90天，请务必划线挑单克隆培养）
四区划线后挑单菌落培养，酵母菌需要先液体复苏再四区划线，再挑单菌落液体培养。
3、穿刺菌种（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）
穿刺接种，液体培养后四区划线，再挑单菌落液体培养。
4、菌落平板（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）
直接挑取单菌落至液体培养基中。
5、液体质粒（冰袋运输，存于-20℃，保质期90天）
单独提取的液体质粒收到后可直接使用。
6、滤纸质粒（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
收到货后将滤纸画圈部分剪下放入EP管中，加100ul无菌水将滤纸浸湿并浸泡5min，吸取5ul质粒转化，离心全涂。
二、转化图片
| P0104/pUG6酵母编辑质粒 |
| P1661/pML104酵母编辑质粒 |
| P1662/pML107酵母编辑质粒 |
| P0370/pCRCT酵母编辑质粒 |
| P4542/pCRCT质粒菌种 |
| P0492/pCRISPRyl酵母编辑质粒 |
| P0493/pCAS酵母编辑质粒 |
| P1401/pCAS1yl酵母编辑质粒 |
| P1876/Cas9-NAT酵母编辑质粒 |
| P1810/p414-TEF1p-Cas9-CYC1t酵母编辑质粒 |
| P2926/p415-GalL-Cas9-CYC1t酵母编辑质粒 |
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文献和实验相关实验
-1,pBADHis, pBADHislacZ，pLLP ompA, pINIIIompA, pMBP-P ,pMBP-C 共表达质粒：pCDFduet-1 以及pCDNA3.1，pEGFP-N2等 大肠杆菌Rosetta（DE3），Rasettagame（DE3），Top10F', BL21(DE3)plySS 等 酵母表达质粒： pPICZαA, pGAPZαA, 酵母细胞 KM71, X33 yingzi
，TaKaRa，有木有；pGM-T，天根，有木有；一些表达载体，使用最广泛的，pET 系列，Novagen 公司（默克）的；有双 MCS 的 Duet 系列载体，Novagen 的；毕赤酵母表达质粒 pPIC3.5k，pPIC9k，pPICZA，pPICZaA 等等，都是 invitrogen 的；另外一些 pYES 酿酒酵母表达系统，也是 invitrogen 的，因此知道常见的质粒是哪个公司的，去他们公司网站上肯定可以找到该质粒的相关信息。在他们公司主页搜索栏直接搜索质粒名称，得到质粒序列，图谱什么的
实验简介噬藻体是水体中常见的浮游病毒，具有控制有害藻华、调节水生态结构、以纳米尺度驱动全球生物地球化学循环、特别是碳循环的一类不可忽视的战略生物资源；异弯藻是水体中的常见藻类，在适宜的温度下会大量生长，曾在大连湾、胶州湾等曾多次形成赤潮，对异弯藻计数是水质检测中常见的检测项目。异弯藻富含叶绿素，叶绿素在蓝光激发下有红色自发荧光；检测水体中大肠杆菌的含量，常作为水体污染指数的衡量标准。本实验用核酸染料 SYBR green I 染色，借助 CytoFLEX 流式细胞仪对噬藻体、大肠杆菌、异弯藻
pETDuet-1大肠双表达质粒
￥100 - 1000
